趙素娥 高欣 劉勝崗 龍靜 周麗華

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的呼吸系統(tǒng)傳染病，我國肺結(jié)核發(fā)病率及死亡率位居所有傳染病首位，為全球第2位[1]?？刂平Y(jié)核病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是控制傳染源，因此肺結(jié)核患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷顯得尤為重要。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)方法周期長，陽性率低，不能滿足臨床快速診斷的需要。近年來，宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS)發(fā)展迅速，它能對微生物的DNA或RNA進行快速測序的技術(shù)，對感染性疾病的診斷具有一定的價值[2-4]。本研究對同期進行MTB痰涂片和培養(yǎng)，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)涂片和培養(yǎng)、熒光定量PCR、Xpert MTB/RIF(簡稱Xpert)及BALF mNGS檢測的患者進行回顧性分析，旨在探討B(tài)ALF mNGS檢測對肺結(jié)核早期診斷的價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020 年5月22日至2021年2月20日長沙市中心醫(yī)院收治、同步行痰液及BALF抗酸染色涂片法、MTB培養(yǎng)法，BALF TB-DNA或Xpert檢測及BALF mNGS的疑似肺結(jié)核患者，且尚未使用抗癆藥物。排除標準：年齡在18歲以下、近期有抗結(jié)核治療史、臨床資料不完整、未同時進行抗酸染色涂片法、MTB培養(yǎng)法及mNGS檢測、診斷不明確者。最終納入155例，男106例，女49例，年齡(59.05±16.45)歲。根據(jù)臨床診斷標準，最后診斷為肺結(jié)核95例(肺結(jié)核組)，男72例，女23例，年齡(59.30±16.46)歲；診斷為非肺結(jié)核60例(非結(jié)核組)，其中感染性疾病54例，嗜血細胞綜合征1例，惡性腫瘤5例，男34例，女26例，年齡(58.66±16.58)歲。本研究通過長沙市中心醫(yī)院倫理委員會批準(批件號：2021-S0197)。

肺結(jié)核診斷標準參照《肺結(jié)核診斷》(WS 288-2017)[5]，臨床診斷標準為：(1)結(jié)合影像特征和結(jié)核免疫學(xué)檢測陽性，排除其他疾病，且抗結(jié)核藥物治療經(jīng)評估有效。確診標準：(2)具有病原學(xué)或者病理診斷依據(jù)，或采用現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測手段(PCR法、基因檢測等)結(jié)合臨床資料等進行綜合分析的確診患者。

二、標本采集

采用日本產(chǎn)Olympus BF-260型電子支氣管鏡灌洗病變肺段，重復(fù)灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液。

三、檢測方法

1 常規(guī)MTB檢查方法 涂片按照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》中的 標準化操作程序，采用美國BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀，具體操作方法參照儀器說明書。

2 熒光定量PCR檢測 運用博奧生物有限公司核酸提取儀提取肺泡灌洗液的結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)，然后運用美國ABI-7500基因擴增儀檢測，具體操作參考試劑說明書。

3 Xpert MTB/RIF檢測 Xpert MTB/RIF按照美國Cepheid公司生產(chǎn)的利福平耐藥實時熒光定量核酸擴檢測系統(tǒng)儀器使用說明書進行操作。

4 宏基因組二代測序技術(shù)檢測 取肺泡灌洗液5 mL以上，送至湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗中心檢測，進行核酸提取及建庫和上機測序，最后進行生信分析及報告，分析流程為：①過濾原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量序列及接頭序列，②初步質(zhì)控后數(shù)據(jù)，③去人源及常見背景微生物序列，④比對微生物數(shù)據(jù)庫(來源：NCBI-RefSeq&Genbank數(shù)據(jù)庫(12800+種)，細菌6600種，真菌980種，病毒5000種，寄生蟲222種，分支桿菌171種，支原體/衣原體97種)，⑤依據(jù)比對情況進行二次過濾，對種屬信息進行統(tǒng)計(NCBI-nt數(shù)據(jù)庫二次比對，與陰性control集進行比較去除假陽性物種)，⑥最終結(jié)果列表。

mNGS報告的解讀依據(jù)《宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》簡稱《中國專家共識》[6]，符合下列標準：①若二代測序結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢查，推薦根據(jù)二代測序結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。②若二代測序結(jié)果陽性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏除二代測序結(jié)果外的其他實驗室支持證據(jù)，應(yīng)進行PCR驗證(在具有合適引物的條件下)，并建議臨床進一步完善可獲得的傳統(tǒng)實驗室檢查加以驗證。③若二代測序結(jié)果陽性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒炇覚z查結(jié)果不支持該結(jié)果，則不能僅根據(jù)二代測序結(jié)果進行診斷，而應(yīng)以傳統(tǒng)實驗室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。MTB為胞內(nèi)致病菌，豐度較低，污染可能性小，當至少1個讀數(shù)被映射到種或?qū)偎綍r，MTB被認為是陽性的[7]。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用“例”和“率(%)”表示；最終臨床診斷為參考標準，計算常規(guī)檢測方法與BALF mNGS在肺結(jié)核中的敏感度，特異度，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值；組間比較采用 χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實驗室檢測結(jié)果

95例肺結(jié)核組中，BALF mNGS檢出MTB陽性55例。肺結(jié)核組中，24例(25.26%)合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌)，以白色念珠菌居多，40例(42.11%)合并細菌感染(見表1)。非肺結(jié)核患者60例，以肺部感染和支氣管擴張合并感染多見(見表2)。

表1 肺結(jié)核組病原菌種類及占比

表2 非肺結(jié)核組病種及占比

二、mNGS MTB檢測陽性者最終均診斷為肺結(jié)核，無假陽性；真菌或細菌檢測陽性者

根據(jù)臨床、實驗室、影像學(xué)和痰液/肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果綜合判斷后進行臨床干預(yù)。肺結(jié)核組中，mNGS及傳統(tǒng)方法(痰及BLAF)共診斷24例合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌感染)，均合并2種及以上病原菌感染，且均入住結(jié)核ICU，并進行了針對性的抗真菌治療。肺結(jié)核組中，mNGS及傳統(tǒng)方法(痰及BLAF)共診斷40例合并細菌感染，其中mNGS及傳統(tǒng)方法一致者11例，mNGS檢出病原體而傳統(tǒng)方法未檢出者19例，傳統(tǒng)方法檢測出而mNGS未檢出者10例。38例進行了針對性的抗感染治療，2例僅使用抗癆藥物。

非結(jié)核組60例，5例惡性腫瘤患者進行了化療或靶向治療及參考病原學(xué)進行抗感染治療。嗜血細胞綜合征1例轉(zhuǎn)血液科繼續(xù)治療。5例非結(jié)核分枝桿菌肺病，3例進行抗NTM治療，2例要求轉(zhuǎn)上級醫(yī)院治療。其他合并細菌或真菌感染者參考mNGS結(jié)果進行了治療。

三、mNGS診斷肺結(jié)核的陽性率與常規(guī)檢測方法的比較

以最終臨床結(jié)果為參考標準，mNGS診斷肺結(jié)核的陽性率為57.89%(55/95)，高于痰抗酸染色涂片法(27.37%，26/95)和痰快培法(30.53%，29/95)，也明顯高于BALF抗酸染色涂片法(15.79%，15/95)和BALF快培法(20.00%，19/95)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；但與BALF Xpert(58.33%，21/36)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.00)；略高于BALF TB-DNA(50%，31/62)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.09)(見表3)。

表3 mNGS與常規(guī)檢測方法陽性率比較

四、mNGS診斷肺結(jié)核的效能與常規(guī)檢測方法的比較(見表4)。

表4 mNGS與常規(guī)檢測方法效能比較

討 論

肺結(jié)核是嚴重危害人類健康的公共問題，早期診斷并及時治療對控制肺結(jié)核的傳染性尤其重要。羅氏培養(yǎng)法為經(jīng)典的診斷肺結(jié)核的“金標準”，但培養(yǎng)周期長，約4～6周，陽性率低。涂片抗酸染色法簡便、快捷，但陽性率亦低。對于無咳痰或痰液含菌量少的患者，支氣管肺泡灌洗液(BALF)抗酸染色涂片及快培成為輔助診斷肺結(jié)核的重要工具，但BALF抗酸染色檢測結(jié)核桿菌要求標本濃度較高，研究顯示[8]，BALF抗酸染色涂片陽性率為15%，診斷價值有限。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，PCR是近年新發(fā)展的分子與基因相結(jié)合的方法，具有較高的靈敏度和特異度，能快速、準確地診斷肺結(jié)核[9]。TB-DNA檢測技術(shù)是通過對DNA片段進行放大擴增，并借助熒光標記探針對結(jié)核桿菌DNA擴增序列進行定量檢測的一種檢測方法。2018年實施的結(jié)核病診斷“新標準”增加了TB-DNA檢測作為結(jié)核病診斷新指標[5]。而Xpert檢測技術(shù)是半巢式實時熒光定量 PCR技術(shù)優(yōu)化，可通過檢測結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB基因與利福平耐藥相關(guān)的81 bp核心區(qū)間[10-11]，能準確、有效檢出結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥的情況，且其檢測時間明顯縮短。TB-DNA和Xpert檢測肺結(jié)核有較高的診斷價值，但肺結(jié)核患者多為混合感染，尤其對于危重癥患者，二者不能檢測其他病原體。

mNGS不基于培養(yǎng)，直接從環(huán)境/臨床樣本中提取全部微生物的核酸，利用基因組學(xué)的方法研究環(huán)境/樣本中所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能，可廣泛分析臨床樣本中微生物組(細菌、真菌、病毒、結(jié)核等)的高通量測序方法。該技術(shù)可準確檢測出標本中的MTB[12-13]?；仡櫺匝芯匡@示其診斷肺結(jié)核的敏感度為59%，顯著高于培養(yǎng)法(26%)[8]。本研究結(jié)果顯示，BALF mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度為57.89%，顯著高于痰涂片法、痰培養(yǎng)法及BALF涂片法及BALF培養(yǎng)法，特異度100%，這與研究一致。這里BALF涂片法及培養(yǎng)法診斷肺結(jié)核的敏感度低于痰涂片法、痰培養(yǎng)法，考慮可能與標本濃度稀釋有關(guān)，提示我們，有自主咳痰能力的患者盡量多次送檢痰涂片或培養(yǎng)。既往研究顯示，對于呼吸道樣本，mNGS對于結(jié)核分枝桿菌的檢出率并不優(yōu)于GeneXpert[14]。本研究顯示BALF mNGS診斷肺結(jié)核的陽性率與BALF Xpert(58.33%，21/36)和BALF TB-DNA(50%，31/62)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。原因考慮為結(jié)核分枝桿菌細胞壁比較厚[15]，破壁困難，常規(guī)核酸提取方法難以保證核酸提取的質(zhì)量。

《中國專家共識》[6]指出，各種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴重感染，建議常規(guī)檢測的同時，開展mNGS。95例肺結(jié)核患者，共35例入住結(jié)核重癥監(jiān)護室，13例行氣管插管，10例合并膿毒癥休克。mNGS檢測出2種及以上病原體者63例(66.32%)，24例(25.26%)合并真菌感染，17例僅抗癆治療，82.11%(78/95)為混合感染，根據(jù)病原學(xué)進行了治療調(diào)整。提示在危重癥感染患者或考慮存在混合感染的病例中，mNGS可提供準確的病原菌診斷信息，減少了臨床經(jīng)驗性廣譜抗生素的使用，可以快速、準確地指導(dǎo)治療。

綜上所述，BALF mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度、特異度和陽性預(yù)測值顯著高于涂片法及培養(yǎng)法，但與BALF TB-DNA及BALF Xpert的陽性率比較無統(tǒng)計學(xué)差異。提示我們，對于輕癥疑似肺結(jié)核患者，不建議行mNGS檢測；對于疑難危重疑似肺結(jié)核患者mNGS為一種快速、全面檢測病原體的診斷方法。