占今舜，詹 康，鐘小軍，霍俊宏*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

肌內(nèi)脂肪含量是衡量肉品質(zhì)的主要指標之一，它與肌肉的多汁性、剪切力、嫩度和風(fēng)味等品質(zhì)性狀有關(guān)［1］。肌內(nèi)脂肪沉積與脂肪酸攝取、脂肪合成和代謝有關(guān)，受畜禽品種、年齡和日糧營養(yǎng)水平等因素的調(diào)控［2］。楊金麗等［3］研究發(fā)現(xiàn)，相對于秸稈精料日糧（精粗比5∶5），青干草精料日糧（精粗比7∶3）能夠促進蒙古羔羊腿部乙酰輔酶A羧化酶ɑ、脂聯(lián)素和瘦素基因的表達，青干草精料日糧能夠促進羔羊腿部脂肪的合成。占今舜等［4］研究發(fā)現(xiàn)，采食精粗比70∶30日糧的犢牛肝臟、十二指腸和瘤胃中的SREBP1和ApoA mRNA相對表達量顯著高于采食精粗比60∶40日糧的；采食精粗比75∶25日糧的犢牛肝臟和十二指腸中的FASN mRNA相對表達量顯著高于采食精粗比65∶35日糧的，而FASN mRNA在瘤胃和肌肉中的相對表達量則相反；SCD1 mRNA在采食精粗比75∶25日糧的犢牛肝臟和十二指腸中的相對表達量最高。以上結(jié)果表明，不同精粗比日糧能夠影響反芻動物體內(nèi)脂肪合成相關(guān)基因的表達，進而影響體內(nèi)脂肪的合成。背膘和肋肉越厚，說明脂肪沉積越高。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，提高日糧的精粗比水平能夠提高山羊背膘厚和肋肉厚，說明提高日糧的精粗比能夠促進脂肪沉積［5］。鑒于此，研究了不同精粗比日糧對山羊組織脂肪酸合成和代謝相關(guān)基因表達的影響，旨在明確日糧影響山羊脂肪沉積是否與其調(diào)控組織脂肪酸合成和代謝相關(guān)基因的表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

試驗選取36只體重相近且健康的努比亞山羊（母羊），將它們隨機分成3組，每組12只羊。試驗羊分別飼喂精粗比為40∶60（精料低水平，L組）、50∶50（精料中水平，M組）和60∶40（精料高水平，H組）的全混合日糧，自由飲水。試驗于2018年11月在九江市修水縣大業(yè)牧業(yè)有限公司肉羊養(yǎng)殖場開始，于次年1月份結(jié)束，整個試驗為期70 d，其中預(yù)飼期為14 d，正試期為56 d。試驗日糧在等蛋能比和鈣磷比下，參照NY/T 816─2004《中國肉羊飼養(yǎng)標準》進行配制，其營養(yǎng)水平見表1。采用圈養(yǎng)方式飼養(yǎng)試驗羊，每天早上8∶00和下午17∶00進行飼喂；其他飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場的規(guī)定。

表1 不同處理的日糧組成與營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 組織樣品的采集

在試驗結(jié)束后，每組選擇體重相近的6只山羊進行屠宰，屠宰后取出肝臟，剪取一小塊肝臟放入凍存管中，然后放入液氮中保存；另外剪取瘤胃和小腸組織，用生理鹽水沖凈內(nèi)容物后放入液氮中；最后將組織轉(zhuǎn)運至實驗室，在-80 ℃下冷凍保存，待測。

1.3 組織RNA的提取和合成

將山羊組織放在液氮中研磨粉碎，然后取50~100 mg粉碎的組織，加入1 mL的Trizol，混勻，靜置5~10 min；根據(jù)天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒說明書中的步驟進行RNA提取。在RNA提取結(jié)束后，用One Drop儀器對組織RNA的濃度和純度進行檢測。采用諾唯贊生物試劑盒進行cDNA的合成，按照試劑盒說明書配制20 μL的反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min；合成獲得的cDNA在-20 ℃下保存，待測。

1.4 引物設(shè)計和Real Time-PCR檢測

參照GenBank中的基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物合成由Invitrogen公司完成。引物序列見表2。按照諾唯贊生物RT-PCR試劑盒說明書中的方法配制20 μL的PCR反應(yīng)體系，在Light Cycler?96 PCR儀（Roche公司）上進行PCR檢測。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。溶解曲線的反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

表2 引物序列與參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

先用EXCEL 2016對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理，根據(jù)2-ΔCt來計算目的基因的相對表達量。然后，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，用LDS法進行差異多重比較。數(shù)據(jù)分析結(jié)果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日糧對山羊組織ACOX1 mRNA表達的影響

由表3可知：ACOX1 mRNA在山羊肝臟和瘤胃中的表達量較高，在腸道中的表達量較低；ACOX1 mRNA在M組山羊瘤胃中的表達量顯著低于其他兩組（P<0.05），在L組山羊空腸中的表達量顯著高于H組（P<0.05）；在山羊肝臟和十二指腸中ACOX1 mRNA的表達量在各組間無顯著差異（P>0.05）。

表3 不同日糧對山羊組織ACOX1 mRNA表達量的影響

2.2 不同日糧對山羊組織CPT1A mRNA表達的影響

從表4中可以看出：CPT1A mRNA在山羊肝臟中的表達量較高，在瘤胃、腸道中的表達量較低；CPT1A mRNA在L組山羊瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），在M組山羊十二指腸中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05）；但在山羊肝臟和空腸中CPT1A mRNA的表達量在各組間無顯著差異（P>0.05）。

表4 不同日糧對山羊組織CPT1A mRNA表達量的影響

2.3 不同日糧對山羊組織PPAR-γ mRNA表達的影響

由表5可見：PPAR-γmRNA在山羊腸道中的表達量較高，在肝臟和瘤胃中的表達量較低；PPAR-γmRNA在L組山羊瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），在H組山羊十二指腸中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），但在肝臟和空腸中的表達量在各組間無顯著差異（P>0.05）。

表5 不同日糧對山羊組織PPAR-γ mRNA表達量的影響

2.4 不同日糧對山羊組織ACACA mRNA表達的影響

從表6可以看出：ACACA mRNA在山羊瘤胃中的表達量較高，在肝臟中的表達量較低，但在腸道中未檢測出；ACACA mRNA在M組山羊肝臟中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），而在瘤胃中的表達量顯著低于其他兩組（P<0.05）。

表6 不同日糧對山羊組織ACACA mRNA表達量的影響

2.5 不同日糧對山羊組織FASN mRNA表達的影響

如表7所示，F(xiàn)ASN mRNA在山羊肝臟中的表達量較高，在瘤胃中的表達量較低，但在腸道中未檢測出；FASN mRNA在L組山羊肝臟中的表達量顯著低于其他兩組（P<0.05），而在瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05）。

表7 不同日糧對山羊組織FASN mRNA表達量的影響

3 討論

酯酰輔酶A氧化酶（ACOX）是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化過程中脫氫反應(yīng)的限速酶，將酯酰輔酶A催化成α，β-反式烯酰輔酶A［6］。ACOX家族有3種亞型，即ACOX1、ACOX2和ACOX3，它們參與過氧化物酶代謝和糖代謝，與脂肪酸代謝及甘油三酯沉積密切相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，增加ACOX1基因的表達量能夠促進脂肪酸的代謝，減少甘油三酯的沉積［8］。本試驗結(jié)果表明，用低精粗比日糧喂養(yǎng)的山羊組織中的ACOX1 mRNA表達量較高，說明低精粗比日糧有助于脂肪酸的代謝，降低甘油三酯的沉積。另外，ACOX1 mRNA在空腸中的表達量隨日糧精粗比的升高而呈降低趨勢，說明提高日糧的精粗比不利于脂肪酸在山羊空腸中的代謝。

肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT1）是脂肪β-氧化的限速酶，它能夠催化酯酰輔酶A在線粒體內(nèi)膜進行β-氧化，從而使脂肪沉積減少［9］。CPT1一般存在CPT1A、CPT1B和CPT1C這3種亞型基因。在機體內(nèi)，CPT1A能夠攜帶長鏈脂肪酸進入細胞膜，促進脂肪酸β氧化，進而減少脂肪的沉積［10］。據(jù)報道，CPT1A基因在山羊肝臟中的表達量要高于在其他組織中的表達量［11］，本試驗結(jié)果與此結(jié)果一致。據(jù)報道，與低精粗比日糧相比，高精粗比日糧能夠顯著降低奶牛肝臟的CPT1A mRNA的豐度［12］，本試驗結(jié)果與此不同，可能是由品種不同造成的。本研究還發(fā)現(xiàn)，CPT1A mRNA在低精粗比日糧組山羊瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組的，在中精粗比日糧組山羊十二指腸中的表達量顯著高于其他兩組的，說明低精粗比日糧能夠促進脂肪酸在山羊瘤胃中的β氧化，而中精粗比日糧有助于促進脂肪酸在十二指腸內(nèi)β氧化。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）在脂肪組織中的表達量較高，是脂肪細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，在分化過程中能夠調(diào)節(jié)脂肪形成并調(diào)控脂質(zhì)代謝［13］。PPAR-γ基因在不同組織中的表達存在差異。在本試驗中，PPAR-γ基因在山羊腸道組織中的表達量較高，在瘤胃和肝臟中的表達量較低。PPAR-γ在與其配體結(jié)合后才能激發(fā)其活性，進而發(fā)揮作用。內(nèi)分泌因子、不飽和脂肪酸及其衍生物是PPAR-γ的原始配體，這些化合物能夠影響機體脂肪的沉積和促進脂肪細胞的分化。來源于草料的不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素可以增強PPAR-γmRNA的表達［14］。本試驗結(jié)果顯示，在低精粗比日糧組山羊瘤胃中PPAR-γmRNA的表達量顯著高于其他兩組的，這可能與其草料比例高，以及不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素等PPAR-γ原始配體高有關(guān)。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)高精粗比日糧能夠促進山羊十二指腸中PPAR-γ基因的表達。

乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）是機體內(nèi)脂肪代謝的關(guān)鍵酶，是脂肪酸合成過程中的第一限速酶；該酶能夠催化乙酰輔酶A生成肪酸合成酶的催化底物丙二酸單酰輔酶A，再與乙酰輔酶A發(fā)生縮合反應(yīng)生成多不飽和脂肪酸。抑制ACACA可以減少脂肪的生成，防止脂肪在肌肉、心臟和肝臟等組織中的積累［15］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，給禁食小鼠飼喂高能量和高脂肪的食物能明顯提高肝臟細胞中ACACA mRNA的表達［16］。因此，在本試驗中，中精粗比日糧組山羊肝臟中ACACA mRNA的表達量高于低精粗比日糧組的，可能與其能量高有關(guān)；而在高精粗比日糧組山羊肝臟中ACACA mRNA的表達量又有所降低，可能與日糧的能量和蛋白含量過高，從而影響到體內(nèi)脂肪酸的合成與代謝有關(guān)。從本試驗結(jié)果來看，中精粗比日糧能夠降低山羊瘤胃中ACACA基因的表達。

脂肪酸合成酶（FASN）能夠?qū)⒁阴］o酶A和丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成軟脂酸，是脂肪酸再生的限速酶。FASN基因主要在脂肪酸合成率高的組織中表達，如肝臟和脂肪組織。FASN的過度表達會引起體內(nèi)脂肪沉積［16］。占今舜等［4］研究發(fā)現(xiàn)，高精粗比（75∶25）日糧組犢牛肝臟中的FASN mRNA表達量顯著高于低精粗比（65∶35）日糧的，而在瘤胃中的FASN mRNA表達量則相反。本試驗結(jié)果也表明，提高日糧精粗比可能會促進山羊體內(nèi)脂肪的沉積。

4 結(jié)論

低精粗比日糧能夠上調(diào)山羊瘤胃中ACOX1、CPT1A、PPAR-γ、ACACA和FASN mRNA的表達，降低肝臟中ACACA和FASN mRNA的表達。高精粗比日糧能夠上調(diào)山羊十二指腸中PPAR-γmRNA和肝臟中FASN mRNA的表達。說明不同日糧精粗比能夠通過調(diào)控脂肪酸合成和代謝相關(guān)基因的表達來影響山羊體內(nèi)脂肪的沉積。