吳浩銘，朱怡軒，曾韋植，劉 梅，李夢飛，勞運濤，張中超，郭 新，李明麗

（云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201）

宣和豬是針對優(yōu)質(zhì)豬肉市場和宣威火腿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需求，以云南地方豬種烏金豬為母本培育的新品種，2018年獲得國家畜禽新品種證書。相較于烏金豬，經(jīng)10余年選育而成的新品種宣和豬在生長、胴體、繁殖等主要生產(chǎn)性能方面都有了明顯的提高，保持了烏金豬原有的肉質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼、母性好以及適應性強等優(yōu)勢［1］，從而表現(xiàn)出了極為明顯的優(yōu)質(zhì)高效的特征，已經(jīng)成為優(yōu)質(zhì)豬肉以及生產(chǎn)宣威火腿的理想豬種。不斷提升宣和豬肉質(zhì)以及生長性能一直是育種工作者們所追求的共同目標。

成 纖 維 細 胞 生 長 因 子14（fibroblast growth factor14，F(xiàn)GF14）基因是成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）基 因 家 族 的 一 員。Godponsrowicz等［2］于1974年在牛腦組織和垂體組織中發(fā)現(xiàn)了成纖維細胞生長因子（FGF），其廣泛分布于無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)，生物學活性比較豐富。研究表明，F(xiàn)GF在機體的自身發(fā)育和多種生理過程中起著至關(guān)重要的作用［3］：（1）影響細胞的增殖、分化及遷移，參與機體組織修復及再生。Goetz等［4］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF是一種分泌蛋白配體，以自分泌、內(nèi)分泌或者旁分泌的方式來維持機體在組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)以及新陳代謝中的效能。FGF不僅和細胞的增殖、分化和遷移有關(guān)，還作用于組織修復和再生，它能使未分化間充質(zhì)干細胞的增殖加快，提高其血管活性［5］。（2）影響胚胎發(fā)育和器官的形成過程。FGF是一種嚴格高度保守的信號分子，在胚胎發(fā)育和大多數(shù)組織器官的形成中發(fā)揮了極其重要的作用。有研究表明，F(xiàn)GF在神經(jīng)誘導、神經(jīng)軸突導向和突觸的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從原腸胚形成開始到胚后發(fā)育過程中都能見到FGFs信號的表達［6］。（3）參與神經(jīng)元的形成。Coebergh等［7］與Brusse等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF14基因突變引起了一種新的脊髓小腦共濟失調(diào)（SCA 27），使小腦和基底神經(jīng)節(jié)發(fā)生神經(jīng)退行性變化。因此，F(xiàn)GF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程、胚胎發(fā)育過程以及細胞分化過程中產(chǎn)生了重要影響。此外，F(xiàn)GF在肝臟、神經(jīng)、脂肪組織中也有良好的修復和再生潛能［9-10］。FGFs的基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列在進化過程中高度保守，多數(shù)成纖維細胞因子通過結(jié)合或激活細胞表面的酪氨酸激酶受體/成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factors receptors，F(xiàn)GFRs）來發(fā)揮其生物學活性［11］。

豬的FGF14基因主要包含了5個外顯子和4個內(nèi)含子，位于豬的11號染色體上。由Ensembl數(shù)據(jù)庫可知，此基因全長為169768 bp，編碼區(qū)長度為1701 bp?，F(xiàn)有研究已證實，F(xiàn)GF14基因?qū)C體物質(zhì)和能量代謝、細胞分裂分化、生存和凋亡等發(fā)育和生理過程均具有重要的調(diào)節(jié)作用。但有關(guān)豬FGF14基因與其與經(jīng)濟性狀的相關(guān)研究還未見報道。本研究將FGF14基因作為宣和豬生長性狀相關(guān)的候選基因，通過分析各SNP變異位點與7個生長性狀間的關(guān)聯(lián)程度，進一步深入探索FGF14基因?qū)π拓i生長性狀的影響，為利用FGF14基因標記改良豬的生長性能提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本次研究所用的366頭（♂163頭，♀203頭）宣和豬的耳組織樣采自云南省宣威市良種豬場，該豬群飼養(yǎng)管理條件一致，系譜清楚、身體健康、發(fā)育正常。所采耳組織均浸泡于裝有75%酒精的EP管中，放于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生長性能測定

本研究共測定了7個生長性能，包括70日齡體重、4月齡體重、6月齡體重、0日齡~4月齡日增重、4月齡~6月齡日增重和70日齡~6月齡日增重。各性狀的測定參照《全國生豬遺傳改良計劃工作手冊》［12］進行，美國Renco背膘儀用來測定宣和豬的活體背膘厚。以上性能測定均在宣威市良種豬場內(nèi)進行。

1.3 基因多態(tài)性檢測

1.3.1 基因組DNA的提取與檢測 使用北京擎科（昆明）生物科技有限公司的試劑盒來提取DNA，提取方式皆按說明書進行。通過點樣于1%的瓊脂糖凝膠和超微量檢測儀（Nano Drop 2000）中對待檢測的DNA樣品進行定性和定量分析。把質(zhì)檢合格后的DNA放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的豬FGF14基因（NC_010453.5）的序列，使用Primer Premeier 5.0軟件設(shè)計1對引物，序列為F：5’-TTGTATGGTCTATTCGTGCCT-3’；R：5’-CAGCTTTCCAGGAGGGTT-3’，送至北京擎科（昆明）生物技術(shù)有限公司合成，預期產(chǎn)物大小為477 bp。

1.3.3 PCR反應體系及程序 PCR擴增反應體系總體積：25 μL，其中，含有Mg2+的10×Buffer（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，前、后引（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1.0 μL以及ddH2O 18 μL。

擴增過程包括：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，設(shè)定35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。

1.3.4 目標片段測序與基因型判定 擴增產(chǎn)物由北京擎科（昆明）生物技術(shù)有限公司來負責DNA序列正向測序。然后通過BioEdit、SeqMan等軟件對DNA序列進行比對分析，篩查SNP位點并通過其堿基序列判定個體基因型。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 基因型頻率和基因頻率計算 根據(jù)FGF14基因分型結(jié)果，統(tǒng)計試驗豬群中各SNP位點不同基因型的個數(shù)，并據(jù)此計算出各位點的基因型頻率、基因頻率、雜合度（heterozigosity， H）和多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC），通過x2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。

1.4.2 單倍型分析 利用Phase 2.0軟件對FGF14基因外顯子4的2個SNPs進行單倍型分析，獲得FGF14基因的單倍型及單倍型組合類型，并計算其單倍型頻率。

1.4.3 不同基因型的性狀差異分析 宣和豬FGF14基因外顯子4上的2個SNPs位點的不同基因型和單倍型組合的生長性狀差異通過下列最小二乘模型進行分析：

式中，Yij表示性狀觀察值；μ表示群體均值；Gi表示FGF14基因各SNP位點的第i基因型（或單倍型組合）效應；Sj表示第j性別效應；eij表示隨機誤差，假定服從N（0，2e）分布。

采用SAS 9.2統(tǒng)計分析系統(tǒng)的GLM過程［13］計算出各SNP位點不同基因型或不同單倍型組合性狀的最小二乘均數(shù)和標準誤，結(jié)果以“最小二乘均數(shù)±標準誤”形式表示，且進行差異顯著性檢驗，以P <0.05作為差異顯著性的判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 FGF14基因的PCR擴增與基因分型

所提取的基因組DNA，條帶清晰明亮無明顯的彌散（圖1）。大?。?77 bp）與所預期結(jié)果相符，滿足進一步測序的最基本要求。

圖1 PCR擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示：FGF14基因外顯子4區(qū)域檢出了2個SNPs位點，即CDS 493 bp處的T→A，593 bp處的A→G，均為同義突變。2個位點均檢測出3種基因型，即T493A的TT、TA和AA基因型（圖2）；A589G位點的AA、AG和GG基因型（圖3）。

圖2 T493A位點的測序結(jié)果

2.2 T493A和A589G位點的多態(tài)性分析

宣和豬FGF14基因外顯子4上的2個突變位點的基因頻率及基因型頻率表現(xiàn)出高度連鎖的規(guī)律（表1）。如表1所示，從基因型頻率上來看，T493A和A589G位點分別以TT（0.6230）基因型和AA（0.5546）基因型的頻率最高，而AA（0.0464）基因型和GG（0.0546）基因型的頻率最低；從基因頻率上來看，T493A位點上的T等位基因頻率（0.7883）高于A等位基因（0.2117）；A589G位點上的A等位基因頻率（0.7500）高于G等位基因（0.2500）；從PIC和H值來看，宣和豬FGF14基因外顯子4的T493A和A589G位點均屬于中度多態(tài)，且都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

2.3 T493A和A589G多態(tài)位點的單倍型分析

宣和豬FGF14基因的T493A和A589G位點的單倍型及其組合頻率見表2。如表所示，共存在4種單倍型頻率由高到低分別為：TA>TG>AA>AG；單倍型組合：9種，以TA/TA組合的頻率最高（0.3525），TA/TG次之（0.2404），TG/AG型組合的頻率最低（0.0109）。

表1 T493A和A589G位點的基因型及基因頻率

表2 T493A和A589G位點的單倍型分析及組合頻率

2.4 各SNP位點不同基因型的生長性狀差異

在所分析的7個生長性狀中，除70日齡體重外，T493A和A589G位點不同基因型在宣和豬其余6個性狀上均存在顯著或極顯著差異（P<0.01或P<0.05）。T493A位點的AA型個體在6月齡體重、70日齡~4月齡日增重、4~6月齡日增重以及70日齡~6月齡日增重上均極顯著高于TT型個體（P<0.01），但是與雜合子之間的差異不顯著（P >0.05），6月齡背膘厚也以AA基因型個體最大，且顯著高于TT基因型個體（P<0.05），而與TA基因型個體間的差異未達到顯著水平（P>0.05）；而A589G位點GG型個體的4月齡體重、6月齡體重、6月齡背膘厚和70日齡~6月齡日增重均為最高（P<0.01或P<0.05）。兩個位點的不同基因型在其他生長性狀上均無顯著差異（P>0.05）。

表3 T493A和A589G位點各基因型的生長性狀

2.5 不同單倍型組合的生長性狀差異

宣和豬FGF14基因T493A和A589G位點不同單倍型組合的生長性狀差異見表4，結(jié)果表明，除了70日齡體重外，9種單倍型組合在其他6種生長性狀上都表現(xiàn)出顯著差異（P<0.01或P<0.05），與單個SNP位點分析結(jié)果保持一致，且2個位點的基因型間表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。此外，在9種單倍型組合中，攜帶有AG單倍型的宣和豬個體在6月齡體重、70日齡~4月齡日增重、4~6月齡日增重及70日齡~6月齡日增重上總體高于其他單倍型組合的個體，T493A位點的A等位基因和A589G位點的G等位基因呈現(xiàn)出協(xié)同增效作用。

3 討論

成纖維細胞生長因子（FGF）是一種能促進成纖維細胞增殖的活性物質(zhì)，促進3T3細胞分裂增殖，在多種生理和發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與細胞增殖與分化、組織修復與再生、胚胎發(fā)育等過程［3］。研究證實，F(xiàn)GF14基因在發(fā)育及成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中表達，特別在退行性神經(jīng)系統(tǒng)中脊髓小腦共濟失調(diào)27型（SCA27）和阿爾茲海默癥中發(fā)揮重要作用［9，14］。但有關(guān)成纖維細胞生長因子14（FGF14）基因在豬上的研究還很少，Tan等［15］對杜洛克豬群進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，其結(jié)果表明，F(xiàn)GF14基因?qū)ωi乳頭數(shù)量有極顯著影響。Yan等［16］對白杜洛克×二花臉F2群體的血液學性狀進行了全基因組序列關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)FGF14基因?qū)?40日齡平均紅細胞的血紅蛋白含量有顯著影響。這些研究結(jié)果表明豬的FGF14基因具有明顯多效性。

表4 不同單倍型組合的生長性狀

本研究在宣和豬FGF14基因外顯子4區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了T493A和A589G兩個位點，均為中度多態(tài)（0.250.05），說明在群體遺傳突變、選擇、遷移和遺傳漂變因素的作用下，該基因處于遺傳動態(tài)平衡［17］。而王思寒等［18］在延邊黃牛FGF14基因的第3外顯子上發(fā)現(xiàn)了1個多態(tài)位點，631947 bp處的A→G，卡方獨立性檢驗結(jié)果顯示，該突變位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)?？梢姡琍ID1基因在不同物種內(nèi)的遺傳差異很大。

不同位點各基因型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明：T493A位點的AA基因型和A589G位點的GG基因型對協(xié)同提高宣和豬生長性能可以產(chǎn)生一定的效應，對6月齡體重、70日齡~4月齡日增重、4月齡~6月齡日增重、70日齡~6月齡日增重和6月齡背膘厚這幾個生長性狀均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.01或P<0.05）；此外，T493A、A589G位點不同單倍型組合在生長性狀上的影響也呈現(xiàn)出明顯的生長階段特異性。在4月齡體重上，以TG/AG組合最高；6月齡體重、70日齡至4月齡日增重、4~6月齡日增重和70日齡~6月齡日增重，以AG/AG組合為最高；而6月齡背膘厚，以TG/TG組合為最高。可見，T493A、A589G兩個位點對目標性狀的影響具有明顯的協(xié)同效應。此外，本研究結(jié)果進一步證實宣和豬FGF14基因與6月齡體重、70日齡~4月齡日增重和6月齡背膘厚存在顯著關(guān)聯(lián)。王思寒等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF14基因不同基因型對16月齡延邊黃牛背高和尻長均具有顯著影響（P<0.05），對24月齡延邊黃牛的體高、體重、十字部高均具有顯著影響（P<0.05）。因此，可以推測FGF14基因?qū)游锏纳L性狀有一定的影響，在不同物種中的影響差異較大。

研究結(jié)果初步表明，F(xiàn)GF14基因與宣和豬的生長性狀間存在顯著關(guān)聯(lián)，是一個有關(guān)于豬生長性狀的重要生長標記，具有重要的研究意義。而目前有關(guān)豬FGF14基因多態(tài)性及其對生長性狀影響的相關(guān)研究還未見報道，若想進一步深入揭示該基因?qū)ο嚓P(guān)性狀的真實效應，還需在不同豬種中對其確切效應加以研究，這對豬育種的實踐應用具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究在宣和豬FGF14基因外顯子4上檢測出了T493A和A589G兩個位點。T493A位點以TT基因型和T等位基因的頻率最高，A589G位點以AA基因型和A等位基因的頻率最高；T493A位點的AA基因型、A589G位點的GG基因型以及AG/AG單倍型組合對宣和豬6月齡體重、70日齡~4月齡日增重、4月齡~6月齡日增重和70日齡~6月齡日增重產(chǎn)生了明顯的協(xié)同促生長效應。