李小玲，華智銳，張 飛，王學軍*

（1.商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.陜西天士力植物藥業(yè)有限責任公司，陜西 商洛 726000）

近年來，由于人類活動產生的溫室氣體，導致全球溫度逐年上升。陜西省地處祖國西北內陸的中緯度地區(qū)，橫跨溫帶、暖溫帶和亞熱帶氣候，具有明顯的大陸性季風氣候。隨著溫室效應的加重，陜西出現(xiàn)高溫天氣的時間越來越長，4~10月均會出現(xiàn)高溫天氣［1］。連續(xù)且頻繁出現(xiàn)的高溫天氣對于植物來說是一個巨大的挑戰(zhàn)，嚴重影響了植物的正常生長。在植物生長的各種脅迫中，植物的生理結構受高溫脅迫的影響較大，植物的正常生長不僅受到影響，嚴重時還會致死［2］。

杜鵑花隸屬于杜鵑花科的杜鵑花屬（Rhododendron）植物，它與龍膽花、報春花并稱為世界三大常見的高山花卉，同時也被評為中國十大名花之一，有較高的觀賞價值和應用價值［3］。據(jù)統(tǒng)計，世界上共有杜鵑270種，中國是杜鵑花的分布中心，有259種，主要分布在我國的高海拔地區(qū)［4］。杜鵑主要分布在海拔500~2500 m的山上灌木叢或松林，它喜歡涼爽、潮濕和通風的半陰涼環(huán)境，生長的適宜溫度為12~25 ℃，夏季溫度超過35 ℃時，新梢、新葉生長緩慢，處于半休眠狀態(tài)［5］。因此，對秦嶺杜鵑進行高溫脅迫的研究，從而篩選出耐高溫的品種，對抵御高溫對秦嶺杜鵑造成傷害尤為重要，有利于其耐熱性的鑒定，從而促進其推廣應用。

本試驗研究以秀雅杜鵑和照山白杜鵑為研究對象，利用人工模擬氣候鑒定法，測定2種高山杜鵑不同高溫脅迫下的熱害指數(shù)及其各項生理生化指標，通過比較不同品種間耐熱性的差異，從而最終篩選出耐熱性強的杜鵑品種，為秦嶺杜鵑的引種和選育培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2021年4月中旬在商洛市鎮(zhèn)安縣木王國家森林公園海拔1500 m左右茨溝杜鵑花景區(qū)采挖生長健壯、無病蟲害的秀雅杜鵑和照山白杜鵑幼苗?；|購自思博礦產品加工廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預培養(yǎng) 預培養(yǎng)：將采挖的照山白杜鵑幼苗和秀雅杜鵑幼苗移栽至外口徑30 cm、高20 cm的花盆中進行預培養(yǎng)（栽培基質為泥炭土∶蛭石=1∶1），將人工氣候箱（HPG-400HX）的培養(yǎng)溫度設置為20 ℃，光照級別設置為1級，濕度設置為80%［6］，光照時間設置為12 h/d培養(yǎng)3 d，期間每天澆250 mL水以保持土壤濕潤。

1.2.2 試驗設計 將預處理完成的試驗材料放入人工氣候箱中模擬高溫條件開始脅迫處理，設置脅迫溫度為白天25 ℃/夜晚17 ℃（對照），白天30 ℃/夜晚22 ℃（輕度高溫脅迫）、白天35 ℃/夜晚27 ℃（中度高溫脅迫）、白天40 ℃/夜晚32 ℃（重度高溫脅迫）4個溫度梯度處理，調配人工氣候箱（HPG-400HX空氣相對濕度為80%，光照級別為1級，光照時間設置為12 h/d，期間每天澆250~500 mL水以保持土壤濕潤，避免由于缺水導致水分脅迫影響數(shù)據(jù)的真實性，脅迫5 d后隨即采集當年生功能葉片（成熟葉）去掉中脈，其中一部分用于丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量的測定，另一部分用于保護酶SOD、CAT和POD活性或含量的測定。

1.2.3 生理指標的測定 MDA含量的測定參照張樂華等［7］的硫代巴比妥酸法；Pro含量的測定采用茚三酮法，參照王凱紅等［8］的方法；SOD活性的測定采用四氮唑藍（NBT）法，參照李合生［9］的方法；POD活性的測定采用分光光度計法，參照Wu等［10］的方法，以1 min吸光度（A）的變化值表示酶活力的大小，即以每分鐘OD470值變化0.01為1個酶活力單位；CAT活性的測定采用紫外分光光度法［11］，以1 min吸光度值（A）減小0.1定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.4 熱害指數(shù)的計算 熱害指數(shù)的計算：高溫脅迫期間，每隔5 d定時對其全部植株生長狀況進行觀察，同時對其高溫脅迫的熱害程度情況進行統(tǒng)計分析和記錄；根據(jù)高溫脅迫對植物的傷害嚴重程度，可劃分為5個級別，其中0級無熱傷害癥狀；1級指1~2片葉子受到熱傷害，即葉片開始變黃枯萎；2級指2~4片葉子變黃，1片葉子枯死；3級指2片葉子枯死；4級指2片葉子以上枯死；5級指整個植株枯死［12］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 所有數(shù)據(jù)測定重復3次，取其3次的平均值。用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用SPSS 18.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫對不同杜鵑品種熱害指數(shù)的影響

由圖1得知，3個溫度脅迫過程中，25 ℃條件下植株生長正常，形態(tài)沒有發(fā)生變化；30 ℃條件下處理5 d后，秀雅杜鵑和照山白杜鵑的熱害指數(shù)分別為0.167、0.333，其中秀雅杜鵑僅1株的形態(tài)未表現(xiàn)出明顯變化，而照山白杜鵑已經出現(xiàn)葉片枯死現(xiàn)象。35 ℃條件處理5 d后，秀雅杜鵑熱害指數(shù)為0.333，表現(xiàn)為植株葉片反卷、下垂，葉子變黃；照山白杜鵑熱害指數(shù)為0.389，表現(xiàn)為枯死現(xiàn)象加重，老葉褐化。而40 ℃條件下處理5 d后，照山白熱害指數(shù)達到0.445，表現(xiàn)為葉片嚴重反卷、下垂，老葉脫落、新葉葉緣、葉尖出現(xiàn)黃色壞死斑。

圖1 高溫脅迫對不同杜鵑熱害指數(shù)的影響

2.2 高溫脅迫對不同杜鵑品種相關生理生化指標的影響

2.2.1 高溫脅迫對不同杜鵑MDA含量的影響 膜脂過氧化作用的產物MDA會對細胞膜起到毒害作用，其含量的高低可作為植物遭受傷害的重要指標［13］。由圖2可得出，高溫脅迫條件下秀雅杜鵑和照山白杜鵑的MDA含量呈先上升后下降趨勢。由此可知，與對照相比，秀雅杜鵑在30 ℃和35 ℃處理下，葉片中MDA含量僅上升2%，沒有表現(xiàn)出顯著性差異（P>0.05），40 ℃處理下，其葉片中MDA含量較對照顯著下降42%（P<0.05）。照山白杜鵑在30 ℃處理下，葉片中的MDA含量無顯著差異；在35 ℃處理下，葉片中的MDA含量達到峰值，其含量較對照顯著上升了31%（P<0.05）；在40 ℃處理下，其葉片含量急劇下降了52%（P<0.05）。以上結果說明，在高溫脅迫下，照山白杜鵑葉片中的MDA含量的影響大于秀雅杜鵑，且在35~40 ℃高溫脅迫下，2種杜鵑葉片的細胞膜均受損，導致MDA含量的大量積累，植株受到傷害。

圖2 高溫脅迫對不同杜鵑MDA含量的影響

2.2.2 高溫脅迫對不同杜鵑Pro含量的影響 由圖3可知，2種杜鵑葉片中的Pro含量均隨溫度升高呈先升后降的變化趨勢。隨著高溫脅迫的加重，Pro含量表現(xiàn)出明顯的差異性。30 ℃處理條件下，秀雅杜鵑葉片的Pro含量顯著上升（P<0.05），比對照增加了30%；35 ℃處理條件下，其葉片中的Pro已經出現(xiàn)下降趨勢，僅比對照增加了7%；40 ℃處理條件下，秀雅杜鵑葉片的Pro含量達到最低（P<0.05），與對照相比顯著降低了16%；30 ℃處理條件下，照山白杜鵑葉片中的Pro含量較對照增加了8%，35 ℃處理后，照山白杜鵑葉片的Pro含量達到最高（P<0.05），與25 ℃對照相比增加了39%；40 ℃處理條件下，照山白杜鵑葉片的Pro含量達到最低（P<0.05），與25 ℃對照相比，顯著降低了11%。由此可知，Pro含量對高溫脅迫的損傷有積極反應，并能主動清除自由基，避免細胞損傷。

圖3 高溫脅迫對不同杜鵑Pro含量的影響

2.2.3 高溫脅迫對不同杜鵑抗氧化酶活性的影響 由圖4、圖5、圖6可知，2種杜鵑葉片中的POD、CAT、SOD活性均隨溫度升高呈先升后降的變化趨勢，且變化顯著（P<0.05）。在40 ℃高溫脅迫下，2種杜鵑POD活性均表現(xiàn)出明顯的差異性（P<0.05）。在30 ℃和35 ℃處理條件下，秀雅杜鵑葉片的POD活性均沒有表現(xiàn)出明顯的差異（P>0.05），與對照相比，秀雅杜鵑葉片中POD活性分別增加了2%、1%；40 ℃處理條件下，其葉片的POD活性達到最低（P<0.05），與對照相比顯著降低了68%；照山白杜鵑在30 ℃處理后，2組間無顯著差異（P>0.05），35 ℃處理后，其葉片的POD活性表現(xiàn)出明顯的差異（P<0.05），與對照相比降低了37%；40 ℃處理條件下，其葉片的POD活性達到最低（P<0.05），與對照相比顯著降低了44%。

杜鵑葉片的CAT活性變化見圖5，秀雅杜鵑和照山白杜鵑分別在35 ℃、30 ℃時酶活性達到頂峰，其活性分別為：7.40，4.27 U/（g·min），較對照分別增加了33%、23%，其中秀雅杜鵑CAT活性增加顯著（P<0.05），而照山白杜鵑增加不顯著（P>0.05）。脅迫40 ℃時，其活性分別為4.90、1.87 U/（g·min），分別比對照下降了12%、29%，2種杜鵑葉片中CAT活性表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。25 ℃處理條件下，2種杜鵑葉片中SOD活性分別是42、50 U/（g·min）。經30 ℃高溫脅迫后，其葉片中的SOD活性表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），與對照相比分別顯著增加了47%、19%（P<0.05）。經35 ℃高溫脅迫后，其活性與對照相比顯著降低了70%、73%（P<0.05）。說明高溫脅迫已經超過了其自身承受能力，并對葉片的抗氧化防御系統(tǒng)造成了破壞。

圖4 高溫脅迫對不同杜鵑POD活性的影響

圖5 高溫脅迫對不同杜鵑CAT活性的影響

圖6 高溫脅迫對不同杜鵑SOD活性的影響

3 討論與結論

3.1 高溫脅迫對杜鵑熱害指數(shù)的影響

在逆境環(huán)境下，植物受傷害強弱最直接的表現(xiàn)是植物外觀形態(tài)的變化，它能將植物在各種逆境環(huán)境下的生長狀況直觀地表現(xiàn)出來［14］。杜鵑花屬植物大多生長在涼爽而潮濕的山地環(huán)境，這些地區(qū)全年最高氣溫不超過28 ℃，而位于海拔1500~3000 m的秀雅杜鵑和照山白杜鵑也不例外，它們喜歡涼爽、潮濕、通風和半陰的環(huán)境［15］。

在本試驗中，2種杜鵑在30 ℃（輕度高溫脅迫）、35 ℃（中度高溫脅迫）和40 ℃（重度高溫脅迫）處理后均受到了傷害，這符合了杜鵑的高溫適應性較差。根據(jù)2種杜鵑生長的形態(tài)指標可得出，25 ℃左右是杜鵑生長的最適溫度，這與趙冰等［16］的研究結果一致；30 ℃會對植物造成輕微傷害，35 ℃和40 ℃高溫處理則會對植株造成嚴重傷害，這與鄭宇等［14］對杜鵑的研究結果一致。

3.2 高溫脅迫對高山杜鵑耐熱生理生化指標的影響

植物細胞與外界環(huán)境之間的媒介是細胞膜。當發(fā)現(xiàn)外界自然環(huán)境對此類植物有害時，首先危害出現(xiàn)在植物膜生態(tài)系統(tǒng)中，其膜脂過氧化作用為主要危害。膜脂過氧化作用的最終產物是MDA，因此植物在高溫脅迫的環(huán)境中，其葉片中的MDA濃度可有效反映細胞膜脂質過氧化的程度［17-18］。本試驗結果表明，30 ℃條件下，2種杜鵑葉片MDA含量較對照均沒有顯著差異；35 ℃處理后2種杜鵑葉片中的MDA含量均達到最高，且照山白杜鵑MDA含量顯著上升（P<0.05），而秀雅杜鵑沒有表現(xiàn)出顯著差異；40 ℃處理后，2種杜鵑葉片中的MDA含量均降至最低且表現(xiàn)出明顯差異（P<0.05），且照山白杜鵑MDA含量降低幅度大于秀雅杜鵑，這與潘向東等［17］的結果一致。在此次試驗中，秀雅杜鵑和照山白杜鵑葉片中的Pro含量均隨溫度脅迫的加重而表現(xiàn)出先升后降的趨勢，秀雅杜鵑在30 ℃脅迫下Pro含量達到頂峰，且表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），照山白杜鵑在35 ℃脅迫下Pro含量達到頂峰，且表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），但在40 ℃處理下2種杜鵑Pro含量均顯著降低（P<0.05）。而周廣等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，Pro含量隨脅迫溫度的上升而呈上升趨勢，這種現(xiàn)象可能是由于本試驗的處理方法、處理時間和脅迫溫度的不同所造成的，也可能與不同杜鵑品種對高溫應激反應的不同有關。具體原因有待進一步試驗調查。

POD、CAT、SOD等都是植物體內清除活性氧的重要保護酶。大量研究表明，在植物遭受高溫脅迫后，隨著體內活性氧的增加其保護酶的活性也表現(xiàn)出增加的變化趨勢，植物的耐熱性與其活性密切相關［19］。本試驗表明，2種杜鵑在高溫脅迫后，其葉片中的POD活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢，與其他保護酶相比，POD酶活性的增幅較小。在30 ℃、35 ℃處理下秀雅杜鵑葉片中POD活性僅比對照增加了2%、1%，沒有表現(xiàn)出顯著差異。但在40 ℃處理下，其活性急劇下降為對照的68%（P<0.05）；照山白杜鵑在30 ℃脅迫下，其葉片中POD活性增加了15%，但在35 ℃脅迫下，其葉片中POD活性已經出現(xiàn)下降趨勢，且較對照顯著降低（P<0.05）；在40 ℃處理下，其葉片中的POD活性降至最低，較對照顯著降低了44%，這與王宏輝等［20］的結果一致。在本試驗中，30 ℃處理下，2種杜鵑葉片中SOD活性顯著上升（P<0.05），與對照分別增加了47%、19%，但在40 ℃處理下其含量分別顯著下降了77%、79%，這與揚華等［21］的結果一致。試驗結果表明，在35 ℃處理下，2種杜鵑葉片中的CAT活性表現(xiàn)出顯著差異，秀雅杜鵑CAT活性顯著增加，而照山白杜鵑較對照顯著下降。2種杜鵑葉片的CAT、SOD酶活性均隨著脅迫溫度的升高而顯著增加，且在30 ℃輕度脅迫時較照山白杜鵑SOD活性而言，秀雅杜鵑活性增幅較大；在35 ℃中度脅迫后秀雅杜鵑CAT酶活性仍然處于上升階段且達到峰值，但照山白杜鵑其活性卻較對照顯著降低。秀雅杜鵑在30 ℃輕度脅迫下SOD酶活性，在35 ℃中度脅迫條件下其POD、CAT酶活性均顯著大于照山白杜鵑，這更加證實了和照山白杜鵑相比秀雅杜鵑具有較強的耐熱性且在高溫脅迫下保護酶活性較高，從而有利于植株減輕或抵抗高溫脅迫所造成的傷害，也符合秀雅杜鵑種植范圍大于照山白杜鵑的事實。

綜上所述，杜鵑花在遭受高溫脅迫后，葉片的相關生理生化指標會發(fā)生一定的變化，其變化趨勢與耐熱性密切相關。秀雅杜鵑具有較強的耐熱性，其保護酶活性在高溫脅迫下普遍較高，且SOD活性增幅較大，對高溫脅迫所造成的傷害起到較高的保護作用；照山白杜鵑耐熱性較弱，其保護酶活性在高溫脅迫下相對較低，對高溫脅迫所造成的傷害保護作用較低。