姜莉莉，武海斌，宮慶濤，張甘雨，王雅紅，孫瑞紅*

（1.山東省果樹研究所/山東省現(xiàn)代設(shè)施果樹技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 泰安 271000；2.泰安市板栗協(xié)會，山東 泰安 271035）

板栗（Castanea mollissima B L）屬殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea），其果實(shí)具有較高的營養(yǎng)和保健價(jià)值，深受消費(fèi)者的喜愛，素有“木本糧食”之稱［1］。中國是世界板栗第一生產(chǎn)大國，種植面積和產(chǎn)量均位居世界首位［2］。

由于板栗大多種植在山區(qū)或坡地上，缺水少路，管理不便，板栗病害發(fā)生嚴(yán)重，一直是困擾栗農(nóng)的重要難題，也是影響板栗質(zhì)量收益的主要因素［3］。同時(shí)，部分板栗種植區(qū)與水源保護(hù)區(qū)毗鄰，病蟲害化學(xué)防控受到限制，安全、精準(zhǔn)防控技術(shù)亟待完善［4］。

栗疫病是由子囊菌亞門核菌綱球殼目間座殼科隱叢殼屬栗疫病菌Cryphonectria parasitica （Murr.） Barr.寄生引起的真菌病害，嫁接不久、生長環(huán)境貧瘠的栗樹易感此病，易成片發(fā)生，甚至導(dǎo)致樹死園毀［5］。任菲等［6］報(bào)道，盾殼霉屬病原菌Coniothyrium phrinum可引發(fā)板栗葉斑病，鏈格孢屬病原菌Alternaria alternata可引起板栗葉焦枯病。姜淑霞等［7］報(bào)道，擬莖點(diǎn)霉屬病原菌Phomopsis mollissmae可侵染板栗引起褐緣葉枯病，并易誘發(fā)板栗疫病。板栗內(nèi)腐病又稱栗種仁斑點(diǎn)病，可在栗果外觀正常的情況下，在種仁上產(chǎn)生壞死性病斑，使果仁失去食用價(jià)值［8］。張馨方等［9］報(bào)道，內(nèi)腐病病原菌從6月中旬授粉期開始侵入板栗花柱和栗苞，8月中旬以后侵入的病菌數(shù)量逐漸增多，但在近成熟期病菌才侵入種仁。內(nèi)腐病由多種病原菌復(fù)合侵染所致，包括膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、聚生小穴殼菌（Dothiorella grgaria）等。

山東省是我國板栗主產(chǎn)區(qū)之一，栽培歷史悠久，品種資源豐富［10］。泰山周邊地區(qū)分布著豐富的古板栗資源，可為板栗良種選育提供豐富且優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)來源［11］。本研究采用高通量測序技術(shù)，分析比較了泰安市岱岳區(qū)祝陽鎮(zhèn)麻塔村古栗與同村種植的“紅栗2號”［12］5年生樹不同物候期及部位的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，比較了采收期果實(shí)營養(yǎng)成分差異，并進(jìn)行了相關(guān)性分析，以期為探索板栗病害的成災(zāi)機(jī)理和科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)取樣區(qū)域

試驗(yàn)區(qū)選址于山東省泰安市岱岳區(qū)祝陽鎮(zhèn)麻塔村（117°21′15″E，36°11′50″N），為山地板栗園。分別隨機(jī)選取3株樹齡30年以上的古栗樹和樹齡5年的“紅栗2號”進(jìn)行取樣，每株為一個(gè)重復(fù)。供采樣板栗樹于2020年5月中旬噴施50%多菌靈可濕性粉劑（山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司）1000倍液和1%阿維·吡蟲啉乳油（順毅股份有限公司）1000倍液，采用常規(guī)栽培管理。

1.2 樣品采集

分別于2020年8月26日（膨果期，p）和9月12日（成熟期，c）采集果實(shí)和葉片。以蘸有0.2 mol/L磷酸緩沖液的無菌拭子擦取板栗葉片（y）和果實(shí)（g）表面的微生物，將拭子置于無菌離心管中，干冰保存送樣。真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的高通量分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

于2020年10月3日采集2種板栗的成熟果仁，用于養(yǎng)分含量測定。

1.3 測序分析

提取樣本基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，以無菌水將其濃度調(diào)整至1 ng/μL。以此基因組DNA為模板，使用帶Barcode的16 S V4區(qū)引物（515F/806R）和ITS1區(qū)引物（ITS1-1F-F/ITS1-1F-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物根據(jù)濃度進(jìn)行等量混樣，以瓊脂糖凝膠電泳純化后進(jìn)行膠回收。構(gòu)建文庫，經(jīng)Qubit定量和檢測合格后，進(jìn)行Ion S5TMXL（Thermofisher）上機(jī)測序。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量剪切，截去Barcode和引物序列，去除嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。以Uparse 7.0.1001軟件對各樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，將一致性高于97%的序列聚類為OTUs，選取頻數(shù)最高的序列作為代表性序列。用Mothur方法與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析，獲得分類學(xué)信息，并分別在界kingdom、門phylum、綱class、目order、科family、屬genus、種species共7個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。以數(shù)據(jù)量最少的樣本為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，并以此進(jìn)行后續(xù)的α-和β-多樣性分析。

使用Qiime軟件計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson、 ACE、Goods-coverage和PD_whole_tree 指數(shù)，使用R軟件（版本號2.15.3）繪制稀釋曲線。采用R軟件的corr.test函數(shù)計(jì)算物種和環(huán)境因子的Spearman相關(guān)系數(shù)值并檢驗(yàn)其顯著性，使用pheatmap函數(shù)進(jìn)行可視化。

1.4 果實(shí)養(yǎng)分含量的測定

可溶性淀粉含量測定采用碘顯色法［13］，可溶性總糖含量測定采用蒽酮比色法［14］，脂肪含量測定采用索氏抽提法［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序深度與數(shù)據(jù)質(zhì)控

由圖1可知，隨著測序深度的增加，各樣本的稀釋曲線均逐漸趨緩，表明測序深度已達(dá)到要求，能夠反映各樣本的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成。

2.2 紅栗和古栗不同物候期和部位的細(xì)菌和真菌α-多樣性指數(shù)的比較

由表1可知，對細(xì)菌而言，古栗膨果期和成熟期葉片和果實(shí)的α-多樣性指數(shù)均高于紅栗，表明古栗樹體的細(xì)菌多樣性、豐度和優(yōu)勢度高于紅栗；其中成熟期古栗果實(shí)（gl.g.c）最高，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指 數(shù) 分 別 為5.242、0.858、1010.069和1019.654，膨果期紅栗果實(shí)（hl.g.p）最低，分別為1.700、0.449、217.546和221.063。對真菌而言，紅栗和古栗各生育期和部位的α-多樣性指數(shù)差異不大，其中膨果期古栗葉片（gl.y.p）最高，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指 數(shù) 分 別 為5.382、0.950、721.374和712.740。

圖1 紅栗和古栗不同物候期各部位樣本的16 S和ITS稀釋曲線

表1 紅栗和古栗不同物候期和部位的細(xì)菌和真菌α-多樣性指數(shù)的比較

2.3 紅栗和古栗不同物候期和部位真菌相對豐度的比較

由圖2可知，紅栗和古栗膨果期果實(shí)（hl.g.p和gl.g.p）的尾孢屬Cercospora相對豐度均較高，紅栗成熟期葉片和果實(shí)（hl.y.c和hl.g.c）的鏈格孢菌Alternaria相對豐度均較高，古栗成熟期果實(shí)（gl.g.c）的墊殼孢屬Coniella相對豐度最高，紅栗膨果期葉片和古栗成熟期葉片（hl.y.p和gl.y.c）的莖點(diǎn)霉屬Phoma相對豐度較高，古栗膨果期葉片和果實(shí)（gl.y.p和gl.g.p）的枝孢屬Cladosporium相對豐度較高，紅栗成熟期葉片（hl.y.c）的柱隔孢屬Ramularia相對豐度較高，古栗成熟期葉片（gl.y.c）的短梗霉屬Aureobasidium相對豐度最高。

2.4 紅栗和古栗不同物候期和部位細(xì)菌相對豐度的比較

由圖3可知，古栗膨果期葉片（gl.y.p）的青枯菌屬Ralstonia相對豐度較高，果實(shí)（gl.g.p）的甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium相對豐度較高。紅栗成熟期果實(shí)（hl.g.c）的滑柱菌屬Herpetosiphon相對豐度較高。古栗成熟期葉片（gl.y.c）的假單胞菌Pseudomonas相對豐度較高，果實(shí)（gl.g.c）鏈球菌屬Streptococcus和根瘤菌屬Allorhizobium相對豐度較高。

2.5 紅栗和古栗果實(shí)養(yǎng)分含量的比較

由表2可以看出，紅栗果實(shí)的可溶性總糖、可溶性淀粉和粗脂肪含量分別為29.70 mg/g、392.41 mg/g和0.48%，均顯著高于古栗的6.63 mg/g、322.42 mg/g和0.29%?？梢娂t栗的營養(yǎng)成分含量遠(yuǎn)高于古栗。

表2 紅栗和古栗養(yǎng)分含量的比較

圖2 紅栗和古栗不同物候期和部位的真菌相對豐度

圖3 紅栗和古栗不同物候期和部位的細(xì)菌相對豐度

2.6 板栗微生物相對豐度與養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析

2.6.1 板栗細(xì)菌相對豐度與養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析 由圖4可以看出，板栗果實(shí)理研菌科Rikenellaceae相對豐度與淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與脂肪含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。短波單孢菌屬Brevundimonas相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關(guān)。埃希氏桿菌屬Escherichia相對豐度與脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)。鞘氨醇單孢菌Sphingomonas相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著正相關(guān)。鏈球菌Streptococcus相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)。根瘤菌Allorhizobium相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關(guān)。

2.6.2 板栗真菌相對豐度與養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析 由圖5可知，板栗果實(shí)座囊菌綱Dothideomycetes相對豐度與糖、淀粉和脂肪含量均呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的病原菌分離鑒定方法僅能研究可培養(yǎng)微生物，而對不可培養(yǎng)的微生物種類及豐度無法進(jìn)行系統(tǒng)分析。高通量測序技術(shù)通過PCR擴(kuò)增，對目標(biāo)區(qū)域的DNA富集后進(jìn)行序列測定，能夠較為全面和準(zhǔn)確地反映微生物群落結(jié)構(gòu)，已成為近年來分析微生物多樣性的常用且有效手段［16］。路穎等［17］采用高通量測序技術(shù)，分析了泰山4種優(yōu)勢造林樹種刺槐、麻櫟、油松和赤松葉片凋落物分解對凋落物內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落多樣性受凋落物化學(xué)性質(zhì)影響，尤其是初始碳氮比和木質(zhì)素氮比。李志杰等［18］以多環(huán)芳烴污染鹽堿土壤為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，分析了翅堿蓬根際與非根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)翅堿蓬能夠有效降低根際土壤鹽含量并改善碳氮比，提高嗜鹽堿多環(huán)芳烴降解微生物的關(guān)鍵基因豐度。

本研究采用高通量測序技術(shù)，分析了板栗不同物候期和部位的真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。真菌相對豐度比較發(fā)現(xiàn)，紅栗和古栗膨果期果實(shí)（hl.g.p和gl.g.p）的尾孢屬Cercospora相對豐度均較高，該屬真菌可引起玉米灰斑?。?9］、甘蔗褐斑?。?0］等病害，但對板栗果實(shí)的危害尚未見報(bào)道。紅栗成熟期葉片和果實(shí)（hl.y.c和hl.g.c）的鏈格孢菌Alternaria相對豐度均較高，表明受板栗葉焦枯病侵染的風(fēng)險(xiǎn)較大［6］。古栗成熟期果實(shí)（gl.g.c）的墊殼孢屬Coniella相對豐度最高，該屬真菌可引起石榴干腐?。?1］、葡萄白腐病等病害，也包括栗生墊殼孢菌［22］。紅栗膨果期葉片和古栗成熟期葉片（hl.y.p和gl.y.c）的莖點(diǎn)霉屬Phoma相對豐度較高，該屬真菌可引起板栗褐緣葉枯病，并易誘發(fā)板栗疫病和內(nèi)腐病。古栗膨果期葉片和果實(shí)（gl.y.p和gl.g.p）的枝孢屬Cladosporium相對豐度較高，該屬病原菌可引起番茄葉霉?。?3］和多種作物果實(shí)腐爛［24］。紅栗成熟期葉片（hl.y.c）的柱隔孢屬Ramularia相對豐度較高，該屬真菌可引起山萵苣白腐病等病害［25］。古栗成熟期葉片（gl.y.c）的短梗霉Aureobasidium相對豐度最高，該屬真菌作為益生菌被廣泛報(bào)道［26-27］。細(xì)菌相對豐度比較發(fā)現(xiàn)，古栗膨果期葉片（gl.y.p）的青枯菌屬Ralstonia相對豐度較高，該屬病原菌可引起煙草青枯病等病害［28］。古栗膨果期果實(shí)（gl.g.p）的甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium相對豐度較高。紅栗成熟期果實(shí)（hl.g.c）的滑柱菌屬Herpetosiphon相對豐度較高。古栗成熟期葉片（gl.y.c）的假單胞菌Pseudomonas相對豐度較高，果實(shí)（gl.g.c）鏈球菌屬Streptococcus和根瘤菌屬Allorhizobium相對豐度較高，均可作為益生菌使用［29-30］。綜合比較可以發(fā)現(xiàn)，紅栗受鏈格孢菌等真菌侵染風(fēng)險(xiǎn)較高，古栗樹體益生菌相對豐度較高。

圖4 板栗細(xì)菌相對豐度與養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析

圖5 板栗真菌相對豐度與養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析

不同產(chǎn)地和品種的板栗中各營養(yǎng)成分含量均有較大差異。本研究通過養(yǎng)分含量測定發(fā)現(xiàn)，紅栗果實(shí)的可溶性總糖、可溶性淀粉和脂肪含量均顯著高于古栗?？梢娊?jīng)過科研人員的多年品種選育，板栗的營養(yǎng)成分性狀已得到系統(tǒng)優(yōu)化和改良。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，短波單胞菌屬相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關(guān)，埃希氏桿菌屬相對豐度與脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)，鞘氨醇單孢菌相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著正相關(guān)，鏈球菌相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)，根瘤菌相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關(guān)。