姚曉云，楊 平，黃永萍，彭志勤，劉 進(jìn)，吳延壽，鄒國(guó)興，尹建華

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/水稻國(guó)家工程研究中心（南昌）/國(guó)家水稻改良中心 南昌分中心/中菲水稻技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330200）

葉綠素是植物吸收、傳遞、轉(zhuǎn)換光能的關(guān)鍵色素，葉綠素含量與功能對(duì)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成具有重要影響［1-3］。近年來(lái)，諸多研究表明葉綠素含量及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)形成存在明顯的影響及調(diào)控作用［4-5］。Jiang等［6］研究表明，較低的葉綠素含量導(dǎo)致光合作用減弱，結(jié)實(shí)率降低，籽粒充實(shí)度下降，進(jìn)而顯著影響稻谷產(chǎn)量；水稻品種葉綠素含量（SPAD值）隨生育進(jìn)程的推進(jìn)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，分蘗期葉綠素含量與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。王志東等［7］研究表明，秈稻黃熟期和蠟熟期劍葉SPAD值與稻米食味值、蛋白質(zhì)含量存在明顯的相關(guān)性，其中黃熟期SPAD值對(duì)品質(zhì)的影響更為顯著，劍葉SPAD值越高，稻米蛋白質(zhì)含量越低，食味品質(zhì)越好。成熟期葉綠素含量降低稱(chēng)為葉綠素降解或衰老，一般發(fā)生在植株自然發(fā)育末期；葉綠素降解發(fā)生的時(shí)期對(duì)于植株最終產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要影響［8］。

水稻葉綠素含量是典型的數(shù)量性狀，受多個(gè)QTL調(diào)控且存在明顯的環(huán)境效應(yīng)［9-10］。近年來(lái)，有關(guān)水稻葉綠素含量的研究較多，已有650個(gè)相關(guān)的QTL被鑒定報(bào)道，但僅有 qLSCHL4、qFCC7L、qSPAD4和qCTH4等少數(shù)幾個(gè)主效QTL被精細(xì)定位或克隆，已定位的位點(diǎn)主要為孕穗~抽穗期葉綠素QTL；而有關(guān)不同生育時(shí)期葉綠素含量動(dòng)態(tài)變化及降解指數(shù)QTL定位的研究相對(duì)較少［11-13］。鑒于此，本研究以屜錦和北陸129雜交-回交衍生的BIL和CSSL群體為試驗(yàn)材料，對(duì)不同生育時(shí)期葉片葉綠素含量和降解指數(shù)進(jìn)行了QTL剖析，旨在發(fā)掘與葉綠素含量和降解指數(shù)相關(guān)的主效QTL，解析不同生育時(shí)期葉綠素含量的變化規(guī)律，為水稻葉綠素含量“階段性”分子遺傳調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與田間試驗(yàn)

以屜錦和北陸129雜交-回交衍生的BIL和CSSL群體為試驗(yàn)材料，遺傳群體均由日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所Yano博士研究團(tuán)隊(duì)提供。試驗(yàn)于2021年在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所南昌試驗(yàn)基地進(jìn)行，于5月18日播種，濕潤(rùn)水育苗；在6月15日移栽，行株距為20 cm×16.5 cm，每穴1苗；其他田間管理與當(dāng)?shù)厣a(chǎn)田相同。

1.2 性狀測(cè)定

在分蘗期、抽穗期和灌漿成熟期選取中間行區(qū)的5個(gè)單株，利用葉綠素儀（SPAD-502 plus） 測(cè)定BIL和CSSL群體各株系的SPAD值，每株系選取5個(gè)單株主莖頂部葉片（劍葉），分別測(cè)定葉片上、中和下3個(gè)區(qū)域的SPAD值，共獲取15個(gè)數(shù)值，利用SPAD指標(biāo)評(píng)價(jià)各株系葉綠素含量，2次生物學(xué)重復(fù)，取均值統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 遺傳圖譜構(gòu)建與QTL分析

BIL群體自2009年引入，經(jīng)多年田間種植后部分株系存在分離和變異，且原遺傳圖譜采用RFLP標(biāo)記構(gòu)建，遺傳距離、標(biāo)記密度與新的SSR和Indel標(biāo)記存在明顯差異。本研究利用新合成的SSR和Indel標(biāo)記重新構(gòu)建分子遺傳圖譜；新遺傳圖譜包括205個(gè)分子標(biāo)記，覆蓋基因組1561.2 cM，標(biāo)記間的平均距離為7.58 cM，染色體平均標(biāo)記數(shù)為17.08個(gè)；CSSL群體的遺傳圖譜參考Ando等［14］公布的數(shù)據(jù)。

采用CTAB法提取水稻基因組DNA，PCR擴(kuò)增體積為10 μL，包括DNA模板1.5 μL、引物（10 μmol/L）各1.25 μL、5.0 μL的2×Es Taq Master PCR混合體系、1.0 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 35 s，55~58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，10 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用4%~5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用QTL ICI Mapping v4.2軟件的完備區(qū)間作圖（ICIM）方法［15］進(jìn)行QTL檢測(cè)分析，LOD閾值設(shè)為2.50，當(dāng)標(biāo)記區(qū)域LOD值≥2.50時(shí)，就判定該區(qū)段存在1個(gè)QTL，同時(shí)估算每個(gè)QTL的加性效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率大小。QTL的命名遵循McCouch等［16］的原則。利用CSSL群體進(jìn)行QTL驗(yàn)證分析，發(fā)掘和驗(yàn)證調(diào)控葉綠素含量的主效QTL，并將染色體片段代換系與受體親本進(jìn)行比較和差異顯著性分析，鑒定相關(guān)主效QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

親本在抽穗期和不同生育時(shí)期的葉綠素含量存在顯著差異，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化特征；高產(chǎn)秈稻北陸129在不同生育時(shí)期的葉綠素含量明顯高于優(yōu)質(zhì)粳稻屜錦，且其降解指數(shù)較小，具有較好的持綠特性。BIL群體各株系的抽穗期、葉綠素含量和降解指數(shù)存在較大變幅，存在超親分布現(xiàn)象，峰度和偏度值接近于1.00，表現(xiàn)為正態(tài)連續(xù)分布，這表明抽穗期、葉綠素含量和降解指數(shù)屬于多基因控制的數(shù)量性狀，符合QTL作圖要求（表1、圖1）。

相關(guān)分析表明：抽穗期僅與降解指數(shù)存在極顯著相關(guān)性，與各生育時(shí)期葉綠素含量未達(dá)到顯著相關(guān)性；抽穗期葉綠素含量與分蘗期、成熟期葉綠素含量存在極顯著相關(guān)；分蘗期葉綠素含量與成熟期葉綠素含量未達(dá)到顯著相關(guān)性；葉綠素降解指數(shù)與抽穗期和成熟期葉綠素含量的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與分蘗期葉綠素含量的相關(guān)性不顯著（表2）。

2.2 QTL分析

BIL群體共檢測(cè)到17個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL，分布于第1~5、7、9和11號(hào)染色體上（表3、圖2），單一QTL解釋13.99%~27.04%的表型變異。檢測(cè)到4個(gè)調(diào)控抽穗期的QTL，分別位于第1、7、11和12號(hào)染色體上，其中qHD7和qHD12的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)值較大，是2個(gè)主效調(diào)控抽穗期的位點(diǎn)；在分蘗期檢測(cè)到4個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL（qCHT2、qCHT4、qCT9和qCT12），其中qCHT2的LOD值和貢獻(xiàn)率最大，分別為13.25%和25.79%；qCHT4和qCHT9的加性效應(yīng)值較大，分別為2.66和-2.72，前者增效等位基因來(lái)自北陸129；檢測(cè)到影響抽穗期葉綠素含量的QTL 4個(gè)，分別位于第2、4、5和9號(hào)染色體上，其中qCHH2和qCHH5的貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值較大；在成熟期檢測(cè)到5個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL，分別為qCHM1、qCHM3、qCHM4、qCHM5和qCHM12，其中qCHM3和qCHM4的貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值較大，且有益增效等位基因均來(lái)自北陸129；檢測(cè)到3個(gè)與葉綠素降解相關(guān)的QTL（qCD3、qCD4和qCD9），其 中qCD4的 貢 獻(xiàn) 率和效應(yīng)值較大，可以延緩葉綠素降解（圖2）。

表1 親本和BIL群體在不同生育時(shí)期葉綠素含量的表型分析

圖1 親本和BIL群體在不同生育時(shí)期葉綠素含量的表型分析

表2 不同生育時(shí)期葉綠素含量相關(guān)分析

圖2 水稻不同生育時(shí)期葉綠素含量QTL染色體分布

2.3 CSSL驗(yàn)證分析

以受體親本屜錦為對(duì)照，將染色體片段代換系的抽穗期葉綠素含量、成熟期葉綠素含量和降解指數(shù)逐一與對(duì)照進(jìn)行差異分析，結(jié)合染色體片段局部代換分析鑒定相關(guān)QTL。研究共發(fā)現(xiàn)葉綠素含量和降解指數(shù)存在顯著差異的株系8個(gè)，包括SL02、SL09、SL14、SL25、SL28、SL32、SL33和SL39（圖3），鑒定出7個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL簇，分別為qSPAD1、qSPAD3、qSPAD4、qSPAD7、qSPAD9、qSPAD10和qSPAD12（表4）。有4個(gè)QTL簇與BIL群體存在共表達(dá)，即qSPAD1與qCHM1，qSPAD3與qCHM3、qCD3，qSPAD4與qCHH4、qCHM4，qSPAD9與qCHT9、qCHH9所在染色體區(qū)域相近；與以往研究比較發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)具有較好的重演性。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的主效QTL qSPAD12。

3 討論與結(jié)論

葉綠素是水稻植株進(jìn)行光合作用的物質(zhì)載體，改良植株的光合性能、提高葉綠素含量是增強(qiáng)光合速率和提高水稻產(chǎn)量潛力的關(guān)鍵所在［17-19］。水稻全生育期葉綠素合成與降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，不同生育時(shí)期葉綠素含量存在動(dòng)態(tài)變化，這種動(dòng)態(tài)變化對(duì)穗部產(chǎn)量和品質(zhì)性狀具有顯著影響，尤以抽穗~成熟期影響效應(yīng)最為顯著。在生育前期葉綠素為營(yíng)養(yǎng)器官形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)；在孕穗~抽穗期葉綠素為鞏固枝梗、積累灌漿儲(chǔ)備物質(zhì)和提高結(jié)實(shí)率奠定基礎(chǔ)；在灌漿成熟期葉綠素為籽粒結(jié)實(shí)、灌漿和粒重形成提供關(guān)鍵物質(zhì)來(lái)源［9，20-21］。本研究表明，不同生育時(shí)期葉綠素含量存在明顯的動(dòng)態(tài)變化，各時(shí)期葉綠素含量存在一定相關(guān)性，抽穗期葉綠素含量與分蘗期、灌漿期葉綠素含量及降解指數(shù)存在極顯著相關(guān)性。研究還發(fā)現(xiàn)，分蘗期親本和BIL群體的葉綠素含量較高，植株葉綠素代謝以合成為主；抽穗后葉綠素含量逐漸降低；灌漿成熟期多數(shù)株系的葉綠素含量顯著降低，葉綠素代謝以降解反應(yīng)為主。此外，研究也表明，抽穗時(shí)期早晚對(duì)葉綠素含量和降解指數(shù)有明顯影響，抽穗期與降解指數(shù)呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。這表明，水稻生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中葉綠素含量依據(jù)源供給和庫(kù)需求表現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)變化，植株生產(chǎn)潛力受葉綠素含量、動(dòng)態(tài)變化和生育期等多因素的共同影響，選育葉綠素含量適宜和源庫(kù)流協(xié)調(diào)的水稻新品種是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的途徑之一。

表3 不同生育時(shí)期葉綠素含量相關(guān)QTL分析

表4 利用CSSL群體鑒定葉綠素含量相關(guān)QTL

調(diào)控不同生育時(shí)期葉綠素含量的QTL不盡相同，控制不同發(fā)育階段葉綠素含量的遺傳基礎(chǔ)存在明顯差異，葉綠素代謝基因存在時(shí)空表達(dá)現(xiàn)象［11，22-23］。阿加拉鐵等［20］對(duì)灌漿結(jié)實(shí)期不同階段葉綠素含量進(jìn)行QTL分析，共檢測(cè)到7個(gè)與葉綠素相關(guān)的QTL，調(diào)控葉綠素含量的QTL存在時(shí)空表達(dá)特性，多數(shù)QTL僅參與調(diào)控某一階段的葉綠素含量，少數(shù)幾個(gè)QTL在整個(gè)時(shí)期持續(xù)表達(dá)；李永洪等［24］利用RIL群體對(duì)分蘗期和抽穗期葉綠素含量進(jìn)行QTL定位，在兩年環(huán)境下共檢測(cè)到30個(gè)QTL，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為5.91%~38.69%，其中8個(gè)位點(diǎn)在不同年份環(huán)境下共性表達(dá)。本研究利用BIL群體對(duì)不同生育時(shí)期葉綠素含量進(jìn)行QTL分析，共檢測(cè)到13個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL，這些QTL大致可分為3類(lèi)：第一類(lèi)為調(diào)控某一時(shí)期葉綠素含量的QTL，包括qCHM1、qCHM3和qCHM4；第二類(lèi)為調(diào)控多個(gè)生育時(shí)期葉綠素含量的QTL，包 括qCHL2（qCHT2、qCHH2）、qCHL4（qCHT4、qCHH4）、qCHL5（qCHH5、qCHM5）和qCHL9（qCHT9和qCHH9）；第三類(lèi)為調(diào)控葉綠素降解的QTL，包括qCD3、qCD4和qCD9，其中降解指數(shù)QTL qCD3與qCHM3、qCD4與qCHM4位于相同染色體區(qū)域，這表明葉綠素降解與定位區(qū)域內(nèi)QTL階段性表達(dá)有關(guān)。

利用CSSL群體初步鑒定了7個(gè)影響葉綠素含量的染色體區(qū)段，其中qSPAD1、qSPAD3、qSPAD4和qSPAD12分別與BIL群體檢測(cè)到的主效QTL簇qCHL1、qCHL3、qCHL4和qCHL12所在染色體區(qū)域相近，這些位點(diǎn)在不同群體中共性表達(dá)，且表型貢獻(xiàn)率較大，可能是決定葉綠素含量的關(guān)鍵QTL。與前人定位結(jié)果標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)qSPAD1與GN1a區(qū)域相近，可能是GN1a基因的多效性；qCHL3與姜樹(shù)坤等［11］鑒定的葉綠素代謝關(guān)鍵區(qū)域qCHH3相近；qCHL4所在區(qū)域?yàn)檎{(diào)控水稻葉綠素含量的熱點(diǎn)區(qū)域，該區(qū)域已有qSPAD4［25］、qCTH4和qNAL1［26］等主效QTL被精細(xì)定位，這些產(chǎn)量相關(guān)基因在水稻品種改良中被有意識(shí)利用，優(yōu)異單倍型在育成品種中廣泛存在。qCHL12/qSPAD12是本研究新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)調(diào)控葉綠素含量的主效QTL，該QTL區(qū)域具有影響抽穗期和調(diào)控不同生育期葉綠素含量的功能，且其LOD值、表型貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值均較大，其相關(guān)染色體區(qū)域的功能和調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步研究確定。