農順強,陳曉昊,許桂丹,韋武均,彭 彬,周 律,鄧益斌

0 引 言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第六位、死亡率居第四位[1]。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是大多數高危HCC地區(qū)的主要危險因素。大量研究表明，HBV參與肝細胞的癌變、侵襲和轉移，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用[2-4]。由于缺乏特征性臨床表現，HCC的大部分診斷多處于晚期，預后較差。盡管一些文獻報道了一些用于早期診斷的血清生物標志物，但結果并不十分令人滿意[5-7]。因此，探求新的早期發(fā)現與早期干預標志物，對于改善肝癌患者預后和提高其長期生存率尤為重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)一般是指長度大于200個核苷酸(nucleotide, nt)，缺乏或者僅有微弱蛋白編碼能力的RNA[8-9]。LncRNA已經被證實在HBV相關肝細胞癌發(fā)生中起著至關重要的作用[10]，然而，關于lncRNAs作為預測性生物標志物和治療靶點的研究仍然非常有限。本研究利用生物信息學方法，篩選出在HBV相關肝癌和癌旁組織差異表達的 lncRNA 和mRNA，探究候選lncRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展進程中的作用機制；對篩選出的lncRNA進行qRT-PCR驗證及受試者工作曲線(ROC)的分析，為進一步揭示HCC的發(fā)病機制提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2019年2月至2020年12月右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科及體檢科患者。腫瘤組(n=45)為HBV陽性原發(fā)性肝癌患者，其中男35例、女10例，年齡(52.2±8.3)歲；對照組(n=58)為乙肝病毒攜帶無腫瘤患者，其中男38例、女20例，年齡(51.0±8.4)歲。2組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經本院醫(yī)學倫理學委員會批準(批準號：2019012601)，患者均簽訂知情同意書。從美國國立生物技術信息中心的GEO數據庫中，獲取3個HBV相關肝癌芯片表達數據集GSE55092、GSE19665和GSE84402。其中GSE55092包括49例肝癌和91例癌旁正常樣本，GSE19665包括肝癌和癌旁正常樣本各5例，GSE84402包括肝癌和癌旁正常樣本各13例，作為差異基因的篩選集。

1.2篩選差異表達基因從Affymetrix官方網站(www.affymetrix.com)下載芯片探針序列FASTA格式文件，使用SeqMap工具將HG-U133_Plus_2芯片的探針序列與GENCODE的人類基因組(GRCh38)(https://www.gencodegenes.org/)(release 30)和lncRNA基因序列進行比對，獲取非編碼RNA(non-coding RNA)和信使RNA(mRNA)探針信息。使用R語言中的limma[11]包標準化數據，將腫瘤組與對照組比較，以差異倍數2倍(|logFC|>1)，P<0.05為標準，獲取差異基因；使用R語言中RobustRankAggreg[12]包，根據差異倍數值對基因進行排序，并選出3個數據集中都存在差異表達的基因。

1.3 篩選HBV相關HCC的候選診斷l(xiāng)ncRNA生物標志物為了篩選HBV相關HCC的最佳診斷l(xiāng)ncRNA生物標志物，利用機器學習，通過使用隨機森林分析進行特征選擇，每個lncRNA的重要性根據平均基尼減少量(mean decrease gini, MDG)排序；通過十乘交叉驗證，MDG值從大到小逐一添加差異lncRNA計算分類結果準確度來確定最佳特征數量。

1.4基因共表達分析、基因功能和通路富集分析根據基因表達值，計算所有篩選出的差異表達lncRNA與mRNA兩兩間的皮爾森相關系數，選取相關系數絕對值|r|>0.5,且校正后P<0.05的lncRNA和mRNA對，納入共表達分析網絡。利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對共表達的差異基因進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，以P<0.05為富集標準。

1.5候選分子在肝癌患者血漿中表達量的驗證利用qRT-PCR檢測候選lncRNA在血漿樣本的相對表達量，并檢測腫瘤組及對照組病例的甲胎蛋白值。對有統(tǒng)計學差異的候選分子進行單個lncRNA或聯合的ROC分析。qRT-PCR試劑為美國Thermo公司的反轉錄試劑RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit及上海翊圣生物科技有限公司的熒光定量試劑Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix?，使用儀器為Lightcycler96熒光定量PCR儀及伯樂BIO-RAD T100TMThermal Cycler型PCR儀；甲胎蛋白的測定為美國雅培i2000SR及其配套試劑。

2 結 果

2.1 差異基因篩選根據篩選條件從表達譜數據集GSE55092, GSE19665和GSE84402中分別提取了103、333、158個差異表達的lncRNA和1182、2147、1579個差異表達的mRNA。根據差異倍數值，對3個數據集差異基因進行排序，然后對3個數據集進行RobustRankAggreg分析，總共從3個數據集中鑒定出38個差異lncRNA，包括25個上調的和13個下調的lncRNA，以及541個DEmRNA，包括195個上調的和348個下調的mRNA，見圖1。

2.2基因共表達分析、基因功能和通路富集分析候選lncRNA與126個mRNA存在共表達，共199個mRNA-lncRNA共表達對。共表達mRNA的GO功能富集結果表明，表達失調的基因主要富集于與單羧酸代謝過程、類固醇代謝過程、細胞分裂、有絲分裂細胞周期過程、基底質膜、紡錘體極、基底外側質膜、基底部分細胞、細胞外空間、紡錘體、輔因子結合、蛋白質同源二聚化活性、輔酶結合、小分子結合、相同蛋白質結合等181個GO條目。KEGG通路分析顯示，差異基因主要富集在p53信號通路、視黃醇代謝、PI3K-Akt信號通路、化學致癌作用和過氧化物酶體等信號通路。見圖2。

行代表差異基因，列代表樣本(綠色和紅色分別表示正常和腫瘤樣品)

圖 2 差異基因GO分析和KEGG分析結果Figure 2 The gene ontology along with the signal pathway enrichments

2.3候選分子在肝癌患者血漿中表達量的驗證對通過數據挖掘挑選出的9個候選lncRNA,在血漿樣本中進一步驗證。EHMT2-AS1、AC093642.1在腫瘤組與對照組間差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；AC003991.1、AL445524.1、LINC00844、AL56056.2、AC008040.1、TRIM52-AS1、LINC01018腫瘤組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，腫瘤組表達上調，見圖3。ROC曲線分析結果顯示，見表1，候選的7個lncRNA對HBV相關HCC的診斷均有一定的價值，其中LINC00844和LINC01018的曲線下面積(AUC)分別為0.851及0.850，具有較高的診斷價值(AUC>0.85), TRIM52-AS1、AC003991.1分類效果較好, AL445524.1分類效果較一般。甲胎蛋白的AUC為0.646(95% CI: 0.5333～0.7586)，見表1。

圖 3 血漿中驗證候選lncRNA的表達量

表 1 單個lncRNA診斷HCC的價值

采用逐步logistic回歸分析，通過選擇赤池信息準則(akaike information criterion, AIC)信息統(tǒng)計量最小來增減變量，AIC的方法是尋找可以最好地解釋數據但包含最少自由參數的模型。結果顯示，LINC01018、AC003991.1、AL445524.1及LINC00844可以作為聯合判別HBV相關HCC的生物標志物。以4個lncRNA在血漿中的相對表達量值聯合及與甲胎蛋白臨床測量值聯合作 ROC曲線分析，構建logistic回歸模型，評價其對HBV相關HCC聯合判別的能力。4-lncRNA聯合構建logistic回歸模型的AUC分別為0.910，敏感度和特異度分別為0.828、0.911； 4-lncRNA與甲胎蛋白聯合構建logistic回歸模型的AUC為0.986，敏感度和特異度分別為0.969、0.964。見圖4。

圖 4 4-lncRNA聯合及與APF聯合的ROC圖

3 討 論

肝癌是一種發(fā)病率及死亡率高的、常見的消化系統(tǒng)腫瘤。目前手術仍是肝癌常規(guī)的治療手段，但基于其起病隱匿、侵襲性強、進展迅速且預后差，大多數患者確診時已是中晚期，5年生存率低[13]。隨著生物信息學的發(fā)展，為疾病診斷及治療靶點的探究提供了新途徑。本研究利用生物信息學方法篩選并驗證了7個lncRNA在HBV相關HCC患者與對照組血漿間存在顯著差異，在評估對HBV相關HCC的鑒別中，7個lncRNA都有一定的診斷價值；我們通過逐步邏輯回歸方法確定將4個lncRNA聯合及與甲胎蛋白聯合來診斷HBV相關HCC，顯示出較高的診斷效能。

研究發(fā)現EHMT2-AS1的變異與慢性乙型肝炎的風險有關[14-15]，其在HBV相關肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制有待進一步研究。研究顯示TRIM52-AS1的敲低可抑制細胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化，并抑制體內腫瘤生長；機制研究表明，TRIM52-AS1通過ceRNA網絡調控機制來影響HCC進展[16]。LINC01018靶向FOXO1競爭性結合miR-182-5p調節(jié)肝癌細胞的增殖及細胞凋亡[17]。此外，報道顯示LINC01018通過LINC01018-hsa-miRNA-574-5p-葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基的ceRNA網絡在HBV誘導的肝癌過程中具有關鍵作用[18]。文獻表明，LINC00844通過調節(jié)藥物代謝酶的表達影響藥物代謝和毒性[19]，LINC00844在HCC中下調，與門靜脈侵犯、高甲胎蛋白及高復發(fā)率等不良腫瘤特征相關，其過表達可使MAPK信號轉導通路失活而顯著抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲[20-21]。

本研究中除EHMT2-AS1、TRIM52-AS1、LINC01018及LINC00844外，其余l(xiāng)ncRNA的相關生物學功能未見報道。鑒于lncRNA作用機制的研究多處于探索階段，而lncRNA-mRNA的共表達分析是鑒定lncRNA潛在靶基因和進一步研究lncRNA生物學功能的常用方法[22]。故本研究構建lncRNA-mRNA的共表達網絡，以預測HBV相關HCC的lncRNA潛在的生物學功能。在差異的mRNA中，STEAP3與AC003991.1、RRM2與AC093642.1、IGFBP3與AL445524.1存在共表達，并富集于p53信號通路。癌細胞因快速增殖需大量鐵，STEAP3編碼的蛋白質能調節(jié)細胞內鐵儲存并幫助腫瘤在缺鐵環(huán)境中生長[23]。STEAP3可與STEAP4形成異二聚體，可影響金屬穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡和細胞周期調控[24]，且AC003991.1是STEAP4反義鏈lncRNA。研究表明反義lncRNA可以通過與鄰近基因形成RNA-RNA二聚體來提高mRNA的穩(wěn)定性，提高基因的表達效率[25-26]。RRM2參與癌細胞的增殖、分化、轉移和耐藥性調節(jié)，在多種癌癥高表達[27-30]。IGFBP3在多種腫瘤中的沉默，過表達IGFBP3可誘導細胞凋亡并抑制細胞存活和生長[31-32]。血清IGFBP3水平與HCC發(fā)病率呈正相關[33]，IGFBP3在HCC中的低表達與腫瘤大小、組織學分化、囊膜侵犯和門靜脈侵犯相關[34]。本研究提示AC003991.1、AC093642.1和AL445524.1可能通過調節(jié)p53信號通路在HBV相關HCC的發(fā)生或發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究中AC008443.1與CYP3A5共表達并富集于視黃醇代謝和化學致癌通路，提示其可能通過調節(jié)CYP3A5的表達或視黃醇代謝和化學致癌作用，參與HBV相關肝癌生發(fā)的調控。CYP3A5在多種腫瘤中異常表達，其異常表達與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[35-36]。此外，CYP3A5可通過調節(jié)mTORC2/Akt信號通路抑制HCC的發(fā)病和轉移，并可作為預后標志物[37-38]。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法，便捷、經濟地篩選到HBV相關肝癌中差異表達的lncRNA，并通過實驗驗證。以上研究結果為HBV相關肝癌的診斷提供了新的潛在循環(huán)分子標記物，有助于肝癌的早期篩查和預防，為臨床上尋找腫瘤新的治療靶點提供了實驗及理論基礎。