燕 霞，楊 梅，蔣雨林，李 林，張東升，李運(yùn)莉，侯 蓉，岳嬋娟，嵇曉光，劉頌蕊*，蘇小艷*

（1.成都大熊貓繁育研究基地四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610081；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625000；3.湖北藍(lán)谷中微生物技術(shù)有限公司，湖北 宜昌 443000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）屬于腸桿菌科，是一種常見(jiàn)的條件性致病菌，廣泛分布在動(dòng)物的呼吸道、消化道及泌尿道系統(tǒng)[1]，是引起膀胱炎和肺炎的主要病原體。碳青霉烯酶（Carbapenemase）是指能夠水解亞胺培南或（和）美羅培南的一類β-內(nèi)酰胺酶，根據(jù)Ambler（氨基酸組成和核苷酸序列）分子分類法將其分為A、B、D 三類[2]。產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae， CRKP）因其治療時(shí)抗生素的選擇非常有限而引起廣泛關(guān)注。據(jù)2019 年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，KP 對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率為10.9%，較2018 年上升了0.8%（http://www.carss.cn/Report/Details/770）。然而，目前對(duì)于野生動(dòng)物源CRKP 的分子流行病學(xué)研究還鮮有報(bào)道。

大熊貓是我國(guó)特有的珍稀保護(hù)動(dòng)物。截至2019年底，全國(guó)野生大熊貓種群數(shù)量為1 700 多只，全球圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達(dá)到600 只[3]。KP 可引起大熊貓出血性腸炎、泌尿生殖道血尿癥、敗血癥等多種疾病[4-5]，對(duì)大熊貓的生命健康造成了嚴(yán)重威脅，而針對(duì)CRKP 的治療更為困難。因此，CRKP 感染的檢測(cè)、預(yù)防和治療對(duì)大熊貓的生命健康具有重要意義。本研究擬對(duì)大熊貓?jiān)碈RKP 進(jìn)行分離鑒定，探究CRKP 在圈養(yǎng)大熊貓中的耐藥及致病情況，為大熊貓臨床抗生素的使用提供指導(dǎo)，也為預(yù)防和控制CRKP 的傳播提供系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物178 株KP 為本實(shí)驗(yàn)室2018年～2019 年分離自成都某大熊貓繁育基地的390 份圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞便。32 只5 周齡雌性SPF 級(jí)昆明小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑MH 瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯、麥?zhǔn)媳葷峁芫?gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酚紅（羅恩試劑）購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；硫酸鋅七水合物購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；亞胺培南粉末、亞胺培南紙片和美羅培南紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基（MIAC）、羧芐青霉素購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Carba NP 實(shí)驗(yàn)酶粗提液由本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)[2]中的方法制備。

1.3 KP 產(chǎn)碳青霉烯酶的表型鑒定采用Carba NP實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行碳青霉烯酶的表型鑒定[2]，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[6]判定鑒定結(jié)果。

1.4 CRKP 的耐藥性檢測(cè)采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）檢測(cè)CRKP 分離株對(duì)亞胺培南、美羅培南和氨曲南等臨床常用的10 種抗生素的敏感性，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)作為判定依據(jù)[6]。

1.5 CRKP 的碳青霉烯酶基因分型檢測(cè)參照文獻(xiàn)[7-8]合成碳青霉烯酶8 種基因（IMI1-3（NMC-A）、SME1-3、KPC2-13、GES11-20、OXA-48、NDM-1、IMP-1、VIM）引物序列， 以細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取的CRKP 分離株DNA 作為模板，采用PCR 方法檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序后比對(duì)分析，確定相應(yīng)的基因型。

1.6 CPKP 對(duì)小鼠致病性試驗(yàn)隨機(jī)選取一株CRKP 分離株（編號(hào)：E28）經(jīng)菌落計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度至1×109cfu/mL。將32 只SPF 級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組8 只。3 個(gè)感染組經(jīng)腹腔注射0.5 mL 菌液，感染菌量分別為：5×108cfu、5×107cfu、5×106cfu；對(duì)照組腹腔注射0.5 mL 無(wú)菌生理鹽水。感染后連續(xù)觀察7 d，并記錄各組小鼠的臨床癥狀和死亡情況；解剖死亡小鼠，觀察其臟器的剖檢病變；采用改良寇氏法計(jì)算CPKP 的半數(shù)致死量（LD50）[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 KP 產(chǎn)碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果Carba NP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，178 株KP 中分離鑒定出8 株CRKP，分離率為4.5%，編號(hào)分別為24，45，74，77，E28，X25，X41，X46（表1）。碳青霉烯酶的出現(xiàn)和流行是造成碳青霉烯類抗生素耐藥性廣泛傳播的主要原因，調(diào)控其表達(dá)的耐藥基因存在于細(xì)菌的質(zhì)?；蛉旧w上，由轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒等可移動(dòng)元件在人群和動(dòng)物攜帶的細(xì)菌之間廣泛傳播[10]。目前，CRKP 在人醫(yī)臨床和畜禽養(yǎng)殖中已得到越來(lái)越多的關(guān)注和研究，但其在野生動(dòng)物中的流行情況還鮮有報(bào)道。據(jù)了解，不同國(guó)家CRKP 的分離率不同，拉丁美洲CRKP的分離率為34.5%、美國(guó)CRKP 的分離率為47.3%、希臘CRKP 的分離率為48.0%[11-12]。2018 年中國(guó)抗生素耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CHINET）報(bào)告顯示，在人類不同類型樣本中CRKP 分離率約為18.4%～64.1%，在家畜中CRKP 的分離率約為9.3%[13]。而本研究在大熊貓中CRKP 的分離率均低于人和家畜，可能與大熊貓臨床治療中碳青霉烯類抗生素使用較少以及大熊貓食物單一，主要食用竹類等原因有關(guān)。

2.2 CRKP 的耐藥性檢測(cè)結(jié)果對(duì)CRKP 分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示：87.5%的CRKP 分離株對(duì)亞胺培南耐藥；25.0%的CRKP 分離株對(duì)多西環(huán)素耐藥；12.5%的CRKP 分離株對(duì)美羅培南、頭孢唑林和氯霉素耐藥（表1），表明本實(shí)驗(yàn)中8 株CRKP 分離株均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，尤其是對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥較為嚴(yán)重。不同國(guó)家和地區(qū)的CRKP分離株對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥性存在差異，如沙特阿拉伯地區(qū)CRKP 分離株對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為55.6%和61.7%，而美國(guó)紐約地區(qū)CRKP 分離株對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為17.0%和20.0%，中國(guó)重慶地區(qū)CRKP 分離株對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為37.2%和30.8%[14-15]。本研究中8 株CRKP 對(duì)亞胺培南的耐藥率（87.5%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)美羅培南（12.5%）的耐藥率。造成這一結(jié)果的原因可能為：一是不同國(guó)家和地區(qū)使用抗生素的習(xí)慣不一樣，從耐藥試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，在大熊貓臨床治療上獸醫(yī)可能更習(xí)慣使用亞胺培南；二是二者的耐藥機(jī)制存在不同，美羅培南的抗菌靶位是PBP2 和PBP3，而亞胺培南僅對(duì)PBP2 有高親和力[16]。同時(shí)，本研究中8 株CRKP 對(duì)氨曲南、卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星和諾氟沙星均敏感（表1），臨床上可考慮選用以上藥物其防治該菌的感染。

表1 CRKP的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Antibiotics susceptibility testing results of CRKP

2.3 CRKP 的碳青霉烯酶基因型檢測(cè)結(jié)果對(duì)8 株CRKP 分離株采用PCR 進(jìn)行碳青霉烯酶基因型鑒定，結(jié)果顯示：在KPC2-13（638 bp）、NDM-1（621 bp）處出現(xiàn)目的條帶（圖1）； PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序后比對(duì)分析，進(jìn)一步確定24、45、77、E28、X25、X41 菌株碳青霉烯酶基因型為blaKPC2-13，74 和X46 菌株碳青霉烯酶基因型為blaKPC2-13+blaNDM-1。表明CRKP 在圈養(yǎng)大熊貓中流行的主要碳青霉烯酶基因型為blaKPC2-13型。CRKP 菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，碳青霉烯酶又分為三類：（1）染色體介導(dǎo)的A類酶，如blaIMI和blaNMC-A；（2）質(zhì)粒介導(dǎo)的A 類酶，如blaGES和blaKPC；（3）金屬酶（B，MBL 類），主要包括blaVIM、blaIMP[10]。埃及和秘魯CRKP 菌株主要流行的是OXA-48 和NDM 型[17]；土耳其CRKP 菌株主要流行的是CTX、SHV、TEM 及KPC 型[18]，而我國(guó)CRKP 菌株主要流行的是KPC 型[19]，表明不同國(guó)家和地區(qū)CRKP 流行株的碳青霉烯酶型不同。本研究分離得到的8 株CRKP 株菌株碳青霉烯酶的基因型為blaKPC2-13（100%）和blaNDM-1（25%），與我國(guó)流行的碳青霉烯酶的基因型結(jié)果一致。

圖1 CRKP分離株的blaKPC2-13基因（A）和blaNDM-1基因（B）擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of blaKPC2-13 gene(A)and blaNDM-1 gene(B)of CRKP isolates

2.4 CRKP 的致病性試驗(yàn)結(jié)果感染組小鼠在感染4 h 后開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、背毛不整、扎堆、呼吸急促、腹瀉等，并在8 h 后出現(xiàn)死亡。5×108cfu 感染組小鼠在感染后16 h 內(nèi)全部死亡，死亡率為100%；5×107cfu 感染組小鼠5 d 內(nèi)持續(xù)發(fā)生死亡，死亡率75%；5×106cfu 感染組和對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)死亡。死亡小鼠剖檢結(jié)果顯示：小鼠腦組織充血；肺臟嚴(yán)重出血；肝臟顏色不均，灰白和暗紅色交織分布；心臟和脾臟顏色發(fā)黑；腸壁透明稀?。▓D2）。感染組小鼠肺部病變嚴(yán)重可能與該菌的致病機(jī)理有關(guān)，KP是呼吸道感染的重要病原，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，其便經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺部而引起大葉或小葉融合性實(shí)變，引起重癥肺炎[20]。改良寇氏法計(jì)算該菌對(duì)小鼠的LD50為5.6×107cfu/mL。上述結(jié)果表明E28 菌株對(duì)小鼠的致病性較強(qiáng)。

圖2 死亡小鼠剖檢病變Fig.2 Anatomy results of dead mice

本研究首次證實(shí)CRKP 存在于圈養(yǎng)大熊貓中，提示在大熊貓等野生動(dòng)物的臨床治療中應(yīng)合理使用抗生素，防止CRKP 進(jìn)一步的擴(kuò)散，本研究為野生動(dòng)物的疾病預(yù)防與治療提供了新的思路。