董 震，王志林，陳啟偉，吳錦艷，尚佑軍，劉永生，楊世華，蘭 喜*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；3.甘肅省定西市安定區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅 定西 743000）

沙門菌屬（Salmonella）是一群寄生在人類和動(dòng)物體內(nèi)，引起腸道系統(tǒng)疾病的革蘭陰性桿菌[1]。鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）是沙門菌屬多價(jià)O抗血清的B 群，是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，廣泛分布于自然界，大小0.6 μm～1.0 μm×2 μm～4 μm，有菌毛、無(wú)莢膜、無(wú)芽孢，多引起胃腸炎，是重要的人獸共患病病原菌[2]。因此，對(duì)鼠傷寒沙門菌開展研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。

自然界中一些致病菌為了能在宿主體內(nèi)生存、增殖和擴(kuò)散，必須分泌一些毒力因子，而一些非致病菌為了適應(yīng)其生活環(huán)境，也向外分泌一些蛋白質(zhì)，使細(xì)菌與外界進(jìn)行能量物質(zhì)交換或是與其他細(xì)菌進(jìn)行信息傳遞。細(xì)菌依賴分泌通路進(jìn)行蛋白質(zhì)跨胞漿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的系統(tǒng)稱為分泌系統(tǒng)[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種細(xì)菌分泌系統(tǒng)[4]。VI 型分泌系統(tǒng)（Type VI secretion system，T6SS）是一種接觸依賴性分泌系統(tǒng)，類似于噬菌體的尾部結(jié)構(gòu)，細(xì)菌將產(chǎn)生的效應(yīng)因子通過(guò)該結(jié)構(gòu)分泌到細(xì)菌胞外[5]。T6SS 有很多功能，例如能增強(qiáng)致病菌與其它細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)力，增加致病菌的毒力等[6]。

Rhs（Rearrangement hotspot）基因在大腸桿菌K-12 型菌株中首次被發(fā)現(xiàn)，該基因最初被認(rèn)為是細(xì)菌發(fā)生基因重組的一個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，并以此命名[7]。在傷寒沙門菌中Rhs 由核心rhs基因和與之相鄰的孤立rhs基因兩部分構(gòu)成[8-9]，核心rhs基因與沙門菌毒力島（Salmonella pathogenicity island，SPI）編碼T6SS 的基因相鄰，沙門菌SPI 編碼不同的調(diào)控蛋白，在其感染的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。 Rhs 蛋白是革蘭氏陰性腸桿菌通過(guò)T6SS 分泌的毒性效應(yīng)因子[11]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌Rhs 蛋白通常攜帶毒素結(jié)構(gòu)域，提示該蛋白可能與細(xì)菌的致病力相關(guān)[12]。革蘭氏陰性菌的Rhs 蛋白參與介導(dǎo)細(xì)菌之間為了生長(zhǎng)而爭(zhēng)奪有限營(yíng)養(yǎng)或空間的競(jìng)爭(zhēng)[13]。但鼠傷寒沙門菌未見(jiàn)相關(guān)研究，為了研究鼠傷寒沙門菌效應(yīng)分子Rhs 的功能，本研究構(gòu)建鼠傷寒沙門菌CVCC541 株的rhs1、rhs2基因缺失株及回補(bǔ)株，比較分析效應(yīng)分子Rhs 對(duì)鼠傷寒沙門菌生物學(xué)特性和致病力的影響，從而為研究該基因在細(xì)菌致病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞鼠傷寒沙門菌株CVCC541，質(zhì)粒pKD46、 pKD4 和pCP20、Hela 細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、DNA 凝膠回收試劑盒、DL5000 DNA Marker 購(gòu)自Ta-KaRa 公司；限制性內(nèi)切酶DpnI 購(gòu)自美國(guó)Promega公司；L-（+）阿拉伯糖購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；Fetal bovine serum（FBS）、培養(yǎng)液DMEM、0.25% Trypsin-EDTA (胰酶）均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Triton X-100 購(gòu)自Sangon 公司；雌性6 周齡體質(zhì)量18 g～20 g SPF 級(jí)昆明（KM）小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI 鼠傷寒沙門菌14028S 基因組序列（CP001363.1），分析rhs1基因（STM14_0340）、rhs2基因（STM14_0341）位置，設(shè)計(jì)敲除引物Rhs1-qcF/R 和Rhs2-qcF/R，鑒定缺失菌株引物Rhs1-jdF/R 和Rhs2-jdF/R，以及一對(duì)卡那霉素抗性基因引物Kan-F/R，用于構(gòu)建回補(bǔ)株的引物Rhs1-EcoR I-F/Rhs1-HindIII-R 和Rhs2-EcoR I-F/Rhs2-HindIII-R，鑒定回補(bǔ)株引物pSTV28-F/R（表1）。引物均由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 rhs1和rhs2基因缺失株的構(gòu)建與鑒定為了獲得rhs1和rhs2同源DNA 片段，分別以Rhs1-qcF/R、Rhs2-qcF/R 為引物，質(zhì)粒pKD4 作為模板。經(jīng)PCR分別擴(kuò)增含上、 下游同源臂及卡那霉素抗性基因的片段rhs1-pKD4、rhs2-pKD4。將pKD46 質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化至傷寒沙門菌CVCC541 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組菌pKD46/CVCC541，將重組菌振蕩培養(yǎng)OD600nm值為0.2 時(shí)，加終濃度為30 mmol/L 的L-（+）阿拉伯糖，誘導(dǎo)至OD600nm≈0.6，制備成感受態(tài)細(xì)胞。將擴(kuò)增得到的rhs1-pKD4 和rhs2-pKD4 基因片段分別電擊轉(zhuǎn)化入pKD46/ CVCC541 感受態(tài)細(xì)胞，以同源重組替換rhs1和rhs2基因，構(gòu)建Δrhs1∷kan和Δrhs2∷kan，并分別利用兩對(duì)鑒定rhs1的引物Rhs1-jdF/Kan-R、Kan-F/Rhs1-jdR，和兩對(duì)鑒定rhs2的引物Rhs2-jdF/Kan-R、Kan-F/Rhs2-jdR 進(jìn)行PCR 鑒定。取上一步鑒定正確的重組菌株Δrhs1∷kan 和Δrhs2∷kan，制備感受態(tài)細(xì)胞，并將pCP20 質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入該感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，42 ℃，振蕩培養(yǎng)。獲得基因缺失菌株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2，利用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.5 rhs1和rhs2基因回補(bǔ)株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的構(gòu)建以鼠傷寒沙門菌CVCC541基因組DNA 作為模板，以Rhs1-EcoR I-F/Rhs1-Hind III-R 和Rhs2-EcoR I-F/Rhs2-Hind III-R 為引物，利用PCR 分別擴(kuò)增包含啟動(dòng)子及開放閱讀框（ORF）的EcoR I-rhs1-Hind III 、EcoR I-rhs2-Hind III 回補(bǔ)基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切純化后克隆至pSTV28表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒pSTV28-rhs1和pSTV28-rhs2，將其分別電轉(zhuǎn)入基因缺失株感受態(tài)細(xì)胞CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2，通過(guò)氯霉素抗性篩選得到回補(bǔ)菌株C-Δrhs1、C-Δrhs2，采用引物pSTV28-F/R 經(jīng)PCR 鑒定并測(cè)序鑒定。

1.6 缺失株的體外遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]的研究方法，將得到的基因缺失菌株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2，以及親本株在無(wú)抗LB 平皿上劃線傳代培養(yǎng)，并分別在第5、10、15、20、25 和30代，挑取單菌落，利用鑒定引物經(jīng)PCR 鑒定基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定分別挑取親本株、基因缺失株和回補(bǔ)株的單菌落，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)17 h 后取各菌液100 倍稀釋后，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 測(cè)定OD600nm，共測(cè)定17 h，并以無(wú)菌LB 培養(yǎng)基為空白對(duì)照測(cè)定OD600nm，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值繪制生長(zhǎng)曲線，完整試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2黏附Hela 細(xì)胞試驗(yàn)按參考文獻(xiàn)[15]方法，將Hela 細(xì)胞以4×105個(gè)/孔，接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待Hela 細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，設(shè)置三個(gè)平行孔并于黏附試驗(yàn)開始前1 h 換DMEM培養(yǎng)。將親本株CVCC541、缺失株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2、回補(bǔ)株C-Δrhs1和C-Δrhs2培養(yǎng)至OD600nm≈0.7，離心菌液收集菌體并用DMEM 培養(yǎng)基將菌液調(diào)整為感染復(fù)數(shù)（MOI）為10 的懸液，接種1 mL/孔，分別感染Hela 細(xì)胞，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)3 h。棄培養(yǎng)基，用PBS 清洗，加入1 mL/孔0.25%的Trypsin-EDTA（胰酶）消化，取100 μL 懸液，10 倍倍比稀釋，涂布于LB 平皿并菌落計(jì)數(shù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)菌黏附率計(jì)算公式：黏附率=（黏附的細(xì)菌數(shù)cfu/最初接種細(xì)菌數(shù)cfu）×100%。

1.9 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2侵襲Hela 細(xì)胞試驗(yàn)各菌株感染細(xì)胞的方法與1.8 黏附試驗(yàn)相同。參照文獻(xiàn)[16]方法，細(xì)菌感染細(xì)胞培養(yǎng)3 h 后棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗，每孔加入1 mL 含慶大霉素（300 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞表面，每孔加入1 mL含濃度為1% Triton X-100 的PBS，吹打使細(xì)胞脫落裂解，取100 μL 懸液10 倍倍比稀釋后涂布于LB 平皿，37 ℃培養(yǎng)記錄菌落個(gè)數(shù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)菌侵襲率計(jì)算公式：侵襲率=（慶大霉素處理得到的細(xì)菌數(shù)cfu/最初接種細(xì)菌數(shù)cfu）×100%。

1.10 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)以每孔約5.4×105個(gè)RAW264.7細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，參照1.8 方法以各菌株感染RAW264.7細(xì)胞，后續(xù)試驗(yàn)方法同1.9，試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算吞噬的細(xì)菌比例，吞噬后細(xì)菌存活率=（被吞噬后存活的細(xì)菌數(shù)量cfu/加入的細(xì)菌數(shù)量cfu）×100%。

1.11 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541 Δrhs2、C-Δrhs1 和C-Δrhs2 對(duì)小鼠半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定將120 只6 周齡的SPF 級(jí)昆明鼠隨機(jī)分為I、II、III、IV、V 5 個(gè)大組，每大組24 只，分別接種CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2，再將各大組分4 個(gè)劑量組，每組6 只，同時(shí)設(shè)定3 只小鼠的對(duì)照組，將細(xì)菌培養(yǎng)到OD600nm為0.8，離心收集菌體，用PBS 重懸并將OD600nm值調(diào)整至1，做10 倍倍比稀釋，分別取10-5、10-6、10-73 個(gè)稀釋度的菌液各0.1 mL 涂布于LB 培養(yǎng)皿中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日菌落計(jì)數(shù)以計(jì)算實(shí)際感染量。其中4 個(gè)不同劑量組分別腹腔注射0.2 mL 的100、10-1、10-2、10-3不同稀釋度的菌液，對(duì)照組經(jīng)腹腔注射0.2 mL 無(wú)菌PBS，接種后小鼠在同等環(huán)境下隔離飼喂，12 h 觀察一次，連續(xù)觀察7 d 并記錄，結(jié)果采用寇氏法（Karber）計(jì)算LD50[17]。

1.12 統(tǒng)計(jì)方法 黏附、侵襲及吞噬后存活試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5 軟件進(jìn)行分析，各組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 或P＜0.01 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用GraphPad Prism 5.0 軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1 rhs1與rhs2缺失株的構(gòu)建及鑒定結(jié)果為了獲得含有卡那霉素抗性基因且?guī)hs1、rhs2同源臂的片段。以pKD4 質(zhì)粒為模板利用Rhs1-qcF/R 和Rhs2-qcF/R 兩對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PCR 分別擴(kuò)增出1 567 bp 的DNA 片段（圖1），與預(yù)期片段大小相符，表明已獲得帶有rhs1和rhs2同源臂的卡那霉素抗性基因片段rhs1-pKD4、rhs2-pKD4。將同源片段rhs1-pKD4 和rhs2-pKD4 分別電轉(zhuǎn)入到含pKD46/CVCC541 的菌株，并以該菌株為模板，利用引物Rhs1-jdF/Kan-R，Kan-F/Rhs1-jdR 和Rhs2-jdF/Kan-R，Kan-F/Rhs2-jdR 對(duì)其進(jìn)行PCR 交叉鑒定，結(jié)果顯示，卡那霉素基因已替換rhs1基因，擴(kuò)增的片段大小為1 172 bp 和1 351 bp；卡那霉素基因已替換rhs2基因，擴(kuò)增大小為1 570 bp 和1 448 bp（圖1），與理論值吻合。測(cè)序結(jié)果顯示，rhs1、rhs2基因同源區(qū)內(nèi)序列已被卡那霉素抗性基因取代，并將新菌株命名為Δrhs1∷kan 和Δrhs2∷kan。

將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入Δrhs1∷kan 和Δrhs2∷kan 菌株制成的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，以篩選后得到的菌株經(jīng)PCR 鑒定結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出535 bp 和1 131 bp 的DNA 片段（圖1），與理論值相符；測(cè)序結(jié)果也顯示目的基因被敲除，將新菌株分別命名為CVCC541 Δrhs1、CVCC541Δrhs2。

圖1 基因缺失菌株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of gene deletion strains CVCC541Δrhs1 and CVCC541Δrhs2 by PCR

2.2 rhs1和rhs2基因回補(bǔ)株C-Δrhs1和C-Δrhs2的構(gòu)建及鑒定結(jié)果為了構(gòu)建基因缺失回補(bǔ)株，將構(gòu)建的回補(bǔ)質(zhì)粒pSTV28-rhs1 和pSTV28-rhs2電轉(zhuǎn)入基因缺失株感受態(tài)細(xì)胞CVCC541Δrhs1和CVCC541 Δrhs2中，分別利用鑒定引物pSTV28-F/R 進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，PCR 擴(kuò)增片段分別為5 971 bp 和2 719 bp（圖2），均與理論值一致，測(cè)序結(jié)果顯示，回補(bǔ)質(zhì)粒已被導(dǎo)入缺失株中。表明正確構(gòu)建了rhs1基因回補(bǔ)株C-Δrhs1和rhs2基因回補(bǔ)株C-Δrhs2。

圖2 基因回補(bǔ)菌株C-Δrhs1與C-Δrhs2的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of gene complement strains C-Δrhs1 and C-Δrhs2 by PCR

2.3 缺失菌株體外遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)對(duì)基因缺失菌株的體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，取5～30代缺失株單菌落，分別采用鑒定引物Rhs1-jdF/R和Rhs2-jdF/R進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示均可擴(kuò)增出535 bp 和1 131 bp 的目的片段，親本株擴(kuò)增出4 316 bp 和1 855 bp 的目的片段（圖3）。表明基因缺失菌株在體外傳代能夠穩(wěn)定遺傳。

圖3 缺失菌株體外遺傳穩(wěn)定性的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of genetic stability of the deletion strains in vitro by PCR

2.4 細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果在不同培養(yǎng)時(shí)間分別測(cè)定鼠傷寒沙門菌親本株、缺失株、回補(bǔ)株懸液的OD600nm值，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，從生長(zhǎng)曲線圖可見(jiàn)培養(yǎng)17 h 期間，0～2 h 為遲緩期、3 h～8 h 為對(duì)數(shù)期、9 h～13 h 為穩(wěn)定期、14 h～17 h 為衰亡期，缺失株、回補(bǔ)株與親本株CVCC541 相比生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異（圖4）。表明Rhs1 和Rhs2 效應(yīng)因子的缺失不影響鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)特性。

圖4 親本株、缺失株、回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of the wildtype,mutants and complement strain

2.5 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2黏附Hela 細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果本試驗(yàn)用Hela 細(xì)胞作為細(xì)胞模型來(lái)比較親本株CVCC541 與缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2及回補(bǔ)株C-Δrhs1、C-Δrhs2對(duì)細(xì)胞黏附能力的差異。結(jié)果顯示，CVCC541 的黏附率為5.213%±0.3744，缺失株CVCC541Δrhs1的黏附率為8.03%±0.9708，缺失株CVCC541Δrhs2的黏附率為8.91%±1.478，回補(bǔ)株C-Δrhs1和C-Δrhs2的黏附率分別為6.543%±0.6835（P＞0.05），5.017%±0.1997。缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和回補(bǔ)株C-Δrhs1、C-Δrhs2的黏附能力與親本株相比均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖5）。表明Rhs1 與Rhs2 效應(yīng)因子的缺失不會(huì)影響鼠傷寒沙門菌對(duì)Hela 細(xì)胞的黏附能力。

圖5 親本株、缺失株、回補(bǔ)株對(duì)Hela 細(xì)胞黏附率的比較Fig.5 Comparison of adhesion rate of the wildtype,mutants and complement strains to HeLa cells

2.6 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541-Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2侵襲Hela 細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果Hela 細(xì)胞模型中親本株與基因缺失株，回補(bǔ)株侵襲率結(jié)果顯示，親本株CVCC541 的侵襲率為0.2295%±0.09785，缺失株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的侵襲率分別為1.144%±0.2308、0.7897%±0.1485，回補(bǔ)株CΔrhs1和C-Δrhs2的侵襲率為0.6320%±0.1371（P＞0.05）、0.4803% ± 0.08939。 與親本株相比， 缺失株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的侵襲能力差異顯著（P＜0.05），且分別提高了4.9倍和3.4倍，回補(bǔ)株CΔrhs1和C-Δrhs2與親本株的侵襲力相比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖6）。表明Rhs1、Rhs2 效應(yīng)因子的缺失會(huì)增強(qiáng)鼠傷寒沙門菌侵襲細(xì)胞的能力。

圖6 親本株、缺失株、回補(bǔ)株對(duì)Hela細(xì)胞侵襲率的比較Fig.6 Comparison of invasion rate of the wildtype,mutants and complement strains to HeLa cells

2.7 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)結(jié)果比較親本株CVCC541、基因缺失株CVCC541 Δrhs1、CVCC541Δrhs2和基因回補(bǔ)株C-Δrhs1、C-Δrhs2在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力。結(jié)果顯示，CVCC541 被巨噬細(xì)胞吞噬后存活率為0.817%±0.1116，缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2吞噬后存活率分別為6.447%±0.4324%、4.86%±0.3787%；回補(bǔ)株C-Δrhs1和C-Δrhs2的吞噬后存活率分別為4.220%±0.5372、3.717%±0.3718（圖7）。相對(duì)于親本株CVCC541，缺失株CVCC541Δrhs1與CVCC541Δrhs2被吞噬后存活力分別上升了7.8 倍和5.9 倍（P＜0.01），而回補(bǔ)株的基因功能部分恢復(fù)（P＜0.05）。結(jié)果表明，Rhs1 和Rhs2效應(yīng)因子的缺失提高了鼠傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力。

圖7 親本株、缺失株、回補(bǔ)株被吞噬后的存活能力Fig.7 Survival rate of the wildtype,mutants and complement strains in phagocytic

2.8 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、對(duì)小鼠LD50測(cè)定結(jié)果親本株CVCC541、基因缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和基因回補(bǔ)株C-Δrhs1、C-Δrhs2經(jīng)腹腔注射感染小鼠，測(cè)定各菌株的LD50。對(duì)小鼠致病性結(jié)果顯示，親本株CVCC541對(duì)小鼠的死亡率為70.8%，LD50為2.53×106cfu/mL；缺失株CVCC541Δrhs1對(duì)小鼠的死亡率為50%，LD50為1.31×107cfu/mL；缺失株CVCC541Δrhs2對(duì)小鼠的死亡率為58.3%，LD50為5.40×106cfu/mL；回補(bǔ)株C-Δrhs1對(duì)小鼠的死亡率為62.5%，LD50為3.82×106cfu/mL；回補(bǔ)株C-Δrhs2的死亡率為62.5%，LD50為4.67×106cfu/mL。缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2與親本株CVCC-541 相比LD50分別下降了5.2 倍和2.1 倍，而回補(bǔ)株的毒力部分恢復(fù)。結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌Rhs1 和Rhs2 效應(yīng)因子的缺失會(huì)降低細(xì)菌的致病力使細(xì)菌的毒力下降。

3 討 論

研究細(xì)菌與宿主之間的相互作用對(duì)于細(xì)菌生理學(xué)和改進(jìn)細(xì)菌感染治療方案具有重要意義。為了更深入了解鼠傷寒沙門菌效應(yīng)因Rhs 在感染與致病過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)功能，本研究利用Red 同源重組技術(shù)構(gòu)建了傷寒沙門菌rhs基因缺失株和回補(bǔ)株，通過(guò)測(cè)定親本株、缺失株、回補(bǔ)株的生物學(xué)特性，初步評(píng)價(jià)了效應(yīng)因子Rhs 在鼠傷寒沙門菌感染和致病過(guò)程中發(fā)揮的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，缺失株經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)后遺傳特性穩(wěn)定；rhs基因的缺失對(duì)鼠傷寒沙門菌的體外生長(zhǎng)和黏附細(xì)胞的能力無(wú)明顯影響，而侵襲細(xì)胞能力和存活能力顯著的上升；通過(guò)構(gòu)建小鼠感染模型進(jìn)行毒力的比較，rhs基因的缺失導(dǎo)致細(xì)菌毒力減弱，進(jìn)而降低了對(duì)小鼠的致死率。這說(shuō)明效應(yīng)因子Rhs 對(duì)鼠傷寒沙門菌在細(xì)胞內(nèi)生存和致病的過(guò)程發(fā)揮著重要作用，可能是決定細(xì)菌在宿主機(jī)體內(nèi)定居、增殖、擴(kuò)散以及致病的重要因子之一。

本實(shí)驗(yàn)敲除了鼠傷寒沙門菌rhs基因?qū)е录?xì)菌在細(xì)胞的侵襲能力和存活能力均增強(qiáng)，這種現(xiàn)象與小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果似乎矛盾。正常情況，缺失rhs基因的細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖加速，可能意味著細(xì)菌毒力的增強(qiáng)，然而這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。推測(cè)原因可能是由于效應(yīng)因子Rhs 具有II 型毒素-抗毒素（Toxin-Antititoxin，T-A）系統(tǒng)中的毒素功能?？苟舅厝菀妆粦?yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶LON 降解[18-19]。有研究鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后LON 表達(dá)上調(diào)[20]，表明在這種情況下抗毒素被加速降解，因?yàn)榧?xì)菌缺乏足夠水平的抗毒素，所以會(huì)導(dǎo)致具有Rhs T-A 系統(tǒng)的細(xì)菌毒素水平上升停止生長(zhǎng)，相反缺乏T-A 系統(tǒng)的突變株生長(zhǎng)受限較小，進(jìn)而使鼠傷寒沙門氏菌rhs基因缺失株比親本株在細(xì)胞內(nèi)的增殖速度更快。本研究團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述推論。

另外有研究表明，Rhs 蛋白毒素殺傷不具有選擇性，同時(shí)銅綠假單胞菌中的rhs基因能編碼一種針對(duì)哺乳動(dòng)物的毒力因子可以調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)，伯氏嗜線蟲致病桿菌的rhs基因可以編碼一種對(duì)線蟲有毒的蛋白質(zhì)[21]，敲除rhs基因的鼠傷寒沙門氏菌SL1344 突變株在感染豬和牛的試驗(yàn)中毒力減弱[22]。Yu 等發(fā)現(xiàn)核盤菌的Ss-Rhs1 是一種分泌型Rhs重復(fù)蛋白它對(duì)細(xì)菌的毒力至關(guān)重要[23]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了本研究小鼠半數(shù)致死量試驗(yàn)得出的關(guān)于效應(yīng)因子Rhs 在細(xì)菌致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的結(jié)論?？梢?jiàn)Rhs 毒素確實(shí)是鼠傷寒沙門菌的毒力因子之一，rhs基因的缺失造成了Rhs 毒素的減少可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)宿主的毒力降低。。

本研究通過(guò)對(duì)傷寒沙門菌rhs1和rhs2基因生物學(xué)特性的探究，一定程度上首次證實(shí)了效應(yīng)因子Rhs 參與了傷寒沙門菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖和存活能力，同時(shí)也表明了該基因與宿主被感染后致病力有密切關(guān)系，為深入研究該基因在細(xì)菌感染及致病宿主機(jī)體的過(guò)程中提供了見(jiàn)解。