陳 濤，朱曉東，孫厚偉，曾勇慶，陳 偉

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.棗莊黑蓋豬養(yǎng)殖有限公司，山東 棗莊 277100）

棗莊黑蓋豬是我國(guó)優(yōu)良的地方豬種之一，具有性成熟和體成熟早、繁殖性能高、肉品質(zhì)優(yōu)良等特征，是典型的華北型豬種[1]。精液品質(zhì)不僅是揭示精液受精能力的綜合指標(biāo)，而且嚴(yán)重影響著豬場(chǎng)的盈虧和豬群的擴(kuò)繁速度。提高地方豬的精液品質(zhì)有利于加快地方豬的擴(kuò)群和遺傳改良，以及提高受胎率。由于精子的生成受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)控，所以精子的生成離不開睪丸的發(fā)育，而睪丸生長(zhǎng)隨年齡的增加發(fā)生相關(guān)的生理變化[2]。

近年來，隨著國(guó)家對(duì)地方豬種質(zhì)資源的重視和非洲豬瘟對(duì)生豬產(chǎn)業(yè)的影響，地方豬的保種和開發(fā)利用迫在眉睫。本研究旨在通過對(duì)棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)與生精小管組織學(xué)進(jìn)行分析，揭示棗莊黑蓋豬公豬繁殖性能的特點(diǎn)，為探究地方豬公種豬的遺傳改良和合理利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)時(shí)間為2020年9月至11月底。試驗(yàn)地點(diǎn)為棗莊黑蓋豬養(yǎng)殖有限公司。選取棗莊黑蓋豬種公豬18頭按年齡分為3組（6頭/組），進(jìn)行精液品質(zhì)測(cè)定。

選取14日齡棗莊黑蓋豬公豬（HG×HG）13頭、80日齡棗莊黑蓋豬公豬（HG×HG）6頭和14日齡杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬（D×HG）17頭，進(jìn)行保定后摘取左側(cè)睪丸，用0.9%生理鹽水清洗，然后放入組織固定液，最后置于4 ℃冰箱保存。

1.2 飼養(yǎng)管理

成年公豬均單欄飼養(yǎng)，自由飲水，半露天式圈舍，自然通風(fēng)，每天飼喂兩次。生長(zhǎng)期公豬5頭/欄，自由采食。免疫、保健和消毒水平均相同。

1.3 棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)測(cè)定

經(jīng)馴化后，多數(shù)公豬可以使用假臺(tái)豬采集精液，部分公豬只能使用發(fā)情母豬作為臺(tái)豬采精，公豬馴化期間放精兩次，間隔5～7 d后進(jìn)行試驗(yàn)，每頭公豬采精3次，采精間隔均為3 d。在棗莊黑蓋豬養(yǎng)殖有限公司獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定，每份精液于10 min內(nèi)完成測(cè)定。精液采集與精液品質(zhì)測(cè)定方法同王黎等[3]所用的方法。

1.4 睪丸組織石蠟切片制作與形態(tài)學(xué)觀察

睪丸組織經(jīng)48 h固定后進(jìn)行橫切，修成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織塊；組織塊經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后切片；石蠟組織切片經(jīng)HE染色后使用中性樹膠封片。

將睪丸組織切片在顯微鏡下用NIS-Element軟件測(cè)量生精小管內(nèi)徑和界膜厚度并拍照。每個(gè)試驗(yàn)組選取橫斷面近似正圓的生精小管100個(gè)，按Makler評(píng)分法對(duì)生精小管內(nèi)徑、基膜厚度、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)和生殖細(xì)胞成熟度評(píng)估，方法同韋思明[4]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistics 26軟件對(duì)精液品質(zhì)性狀的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)；采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)Makler評(píng)分進(jìn)行t檢驗(yàn)并做圖；使用Photoshop CC 2019軟件處理圖片。所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)分析

棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)中的精子密度（圖1A）、精子活力（圖1B）和精子活率（圖1C）隨著年齡的增加呈降低趨勢(shì)，這3個(gè)性狀均以1～2歲組最高，極顯著高于3～4歲組和5～6歲組。而精子畸形率以5～6歲組最高（35.83%），1～2歲組最低（10.50%），各組間呈極顯著差異（圖1D）。3～4歲組棗莊黑蓋豬的pH（圖1E）、采精量（圖1F）和采精時(shí)間（圖1G）極顯著高于1～2歲組（P＜0.01），同樣高于5～6歲組但差異不顯著（P＞0.05）。精液的溫度隨年齡的增加呈上升趨勢(shì)（圖1H）。

圖1 棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)分析

2.2 精液品質(zhì)各性狀相關(guān)性分析

由表1可知，棗莊黑蓋豬的精子活力與活率呈強(qiáng)度正相關(guān)，而二者與畸形率分別呈強(qiáng)度和中度負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；精液溫度與畸形率存在強(qiáng)度正相關(guān)，與活力和活率則存在中度負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。此外，采精量與采精時(shí)間存在極強(qiáng)正相關(guān)，且二者均與精液pH存在強(qiáng)度正相關(guān)（P＜0.01）。

表1 棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)各性狀相關(guān)性

2.3 棗莊黑蓋豬睪丸組織學(xué)和Makler評(píng)分分析

將HE染色后的組織切片置于顯微鏡下觀察（40×），棗莊黑蓋豬睪丸組織中曲細(xì)精管的生殖細(xì)胞層數(shù)（圖2A）和內(nèi)徑（圖2B）隨著日齡增加而增加。80日齡棗莊黑蓋豬公豬睪丸組織中生精小管內(nèi)徑（圖2C）、界膜厚度（圖2D）、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)（圖2E）、生殖細(xì)胞成熟度（圖2F）和Makler評(píng)分（圖2G）均高于14日齡棗莊黑蓋豬（P＜0.01）。

圖2 棗莊黑蓋豬睪丸組織學(xué)（40×）和Makler評(píng)分分析

2.4 棗莊黑蓋豬雜交后代睪丸組織學(xué)和生精小管Makler評(píng)分分析

將HE染色后的組織切片置于顯微鏡下觀察（20×），在相同視野下14日齡的杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬（圖3A）的生精小管比14日齡棗莊黑蓋豬公豬的排列更加緊密（圖3B）；而且杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬的生精小管內(nèi)徑（圖3C）、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)（圖3D）和Makler評(píng)分（圖3E）均顯著高于棗莊黑蓋豬（P＜0.05），但是界膜厚度和生殖細(xì)胞成熟度沒有差異。

圖3 不同父本間豬睪丸組織學(xué)（20×）和Makler評(píng)分分析

2.5 棗莊黑蓋豬曲細(xì)精管生殖細(xì)胞發(fā)育分析

為探究80日齡棗莊黑蓋豬曲細(xì)精管生殖細(xì)胞發(fā)育程度，對(duì)棗莊黑蓋豬曲細(xì)精管腔內(nèi)生殖細(xì)胞進(jìn)行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)靠近基膜的精原細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，多數(shù)曲細(xì)精管內(nèi)形成管腔（圖4A和圖4B）；基膜至管腔間出現(xiàn)大量減數(shù)分裂Ⅰ期和減數(shù)分裂Ⅱ期精母細(xì)胞；延伸形態(tài)精子依附于基膜、支持細(xì)胞或游離于管腔附近，在靠近管腔處發(fā)現(xiàn)精子殘余體和大量圓形精子（圖4C），說明80日齡棗莊黑蓋豬已進(jìn)入初情期。

圖4 棗莊黑蓋豬曲細(xì)精管生殖細(xì)胞發(fā)育分析（40×）

3 討論

3.1 年齡對(duì)棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)的影響

地方豬養(yǎng)殖中的配種方式多以本交為主，較少使用人工授精進(jìn)行擴(kuò)繁，導(dǎo)致種公豬利用率和擴(kuò)繁效率較低。公豬精液品質(zhì)一般從1歲后開始升高，在2～3歲時(shí)精液品質(zhì)達(dá)到最佳，然后在4歲以后開始下降；而后備公豬最初的精液中往往含有大量死精和畸形精子，導(dǎo)致其精液品質(zhì)較差[3]。公豬睪丸溫度升高會(huì)改變類固醇的生成，伴隨著過度的熱傳遞可能會(huì)影響精子結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致射精量減少、精子活力下降、畸形精子數(shù)的增加[5]。精液品質(zhì)雖然不會(huì)立即受到睪丸溫度變化的影響，但會(huì)在熱應(yīng)激后兩周開始下降，直到熱應(yīng)激結(jié)束8周后才恢復(fù)正常[6-8]。為減少熱應(yīng)激對(duì)精液品質(zhì)的影響，本研究選擇秋季進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著棗莊黑蓋豬年齡的增長(zhǎng)，精子密度、精子活力和精子活率均呈下降趨勢(shì)，而精子畸形率和精液溫度則呈上升趨勢(shì)，說明棗莊黑蓋豬精液品質(zhì)受年齡影響較為顯著；這是由于睪丸組織的生精功能發(fā)生了與年齡相關(guān)的組織學(xué)變化，導(dǎo)致射精量和精子活率的下降，從而影響精液品質(zhì)[2]。因此，在棗莊黑蓋豬的保種工作中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)年輕公豬的飼養(yǎng)管理以提高核心群擴(kuò)繁的效率；在夏季適當(dāng)添加氨基酸和維生素以提高性欲并改善精液品質(zhì)[9-10]。

3.2 日齡和父本對(duì)生精小管發(fā)育的影響

睪丸的組織學(xué)和生理學(xué)變化與年齡極為相關(guān)，尤其表現(xiàn)在精子產(chǎn)生和生殖激素功能的改變。年齡對(duì)睪丸組織學(xué)的影響在人類醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域較為成熟，而對(duì)地方豬的研究有限[2，11]。本研究利用Makler評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估了棗莊黑蓋豬睪丸組織學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)棗莊黑蓋豬生精小管內(nèi)徑和管壁生殖細(xì)胞層數(shù)隨著日齡的增加而增加。而相同日齡條件下，杜洛克公豬與棗莊黑蓋豬母豬雜交的F1代公豬除界膜厚度和生殖細(xì)胞成熟度均高于純種棗莊黑蓋豬，說明前者具有一定的雜交優(yōu)勢(shì)，可能更早進(jìn)入體成熟階段[12]。通過對(duì)睪丸組織切片的HE染色進(jìn)行生精上皮組織形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)純種棗莊黑蓋豬生精小管在80日齡時(shí)出現(xiàn)管腔，并伴有少量精子產(chǎn)生，同時(shí)在切片中發(fā)現(xiàn)各級(jí)生殖細(xì)胞；棗莊黑蓋豬與太湖豬相比，純種棗莊黑蓋豬在80日齡時(shí)生精小管直徑為141.96 mm，大于120日齡太湖豬的122.64 mm[13-14]；綜上結(jié)果表明，棗莊黑蓋豬在80日齡達(dá)到初情期并具有一定的受精能力和早熟特性。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，從棗莊黑蓋豬精子密度、精子活力和精子畸形率等方面綜合考慮，棗莊黑蓋育種核心群中的種公豬年齡結(jié)構(gòu)應(yīng)以1～2歲為主，可縮短育種群的世代間隔，加快遺傳進(jìn)展。此外，研究發(fā)現(xiàn)棗莊黑蓋豬公豬的初情期較早，可為棗莊黑蓋豬公豬繁殖性能及初情期的確定提供參考。