劉 燕，羅文敏，段如雁，李 蕓，楊秀忠

(1. 貴州省生物研究所, 貴陽 550009；2. 威寧自治縣山地特色農業(yè)科學研究所，貴州 威寧 553100)

【研究意義】威寧縣地處貴州省西部，屬于高海拔高寒地區(qū)，該地氣候溫和，冬無嚴寒、夏無酷暑，有利于茶葉有機物的合成和積累[1]，產出的茶葉氨基酸、咖啡堿、黃酮、維生素和芳香類物質含量均高于低山地區(qū)[2]。生長在海拔1900～2200 m的威寧高山茶，因其香味濃厚、回味甘甜、經(jīng)久耐泡和獨特的“豆香味”而深受人們喜愛。但威寧縣春季降水偏少[2]，平均月雨量低于150 mm，春季干旱嚴重抑制了幼林茶樹生長，影響了威寧高山茶的產量和品質，減少了茶農的經(jīng)濟收入。因此，選擇抗旱性強的茶樹品種對威寧地區(qū)茶產業(yè)的健康發(fā)展有積極的促進作用?！厩叭搜芯窟M展】葉片的顯微結構是茶樹生長發(fā)育過程一系列生理活動基礎，與茶樹的分類、遺傳和抗逆性等具有密切關系[3]。黎釗等[3]研究發(fā)現(xiàn)，葉片較厚的茶樹品種比葉片較薄的茶樹抗旱性強，表皮厚度大的茶樹品種比表皮厚度小的抗旱性強。楊鳳等[4]則指出，葉片柵欄組織層數(shù)多、柵海比(柵欄組織/海綿組織)高的茶樹比柵欄組織層數(shù)少、柵海比小的茶樹抗旱性強[4]。除了葉片解剖結構的改變外，茶樹在生理生化上也會對干旱產生積極響應[5]。茶樹可通過提高自身調節(jié)滲透能力、改變保護酶活性等生理活動來適應干旱[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c】植物的抗旱性受多種因素影響。前人對茶樹種質資源抗旱性評價大多采用單個指標進行分析，對數(shù)據(jù)綜合考量較少[8]，單個指標評定植物抗旱性容易造成的數(shù)據(jù)的孤斷性。采用多項指標對植物抗旱性進行綜合評價，評定結果與實際情況更加接近[9]。隸屬函數(shù)法可結合多項測定指標，對材料特性進行綜合評價，克服單一研究指標的不足[8]?！緮M解決的關鍵問題】以威寧縣茶產區(qū)收集到的9份茶樹種質資源為試驗材料，對其進行葉片解剖結構觀察、抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質的測定，探究其在葉片解剖結構和生理上的差異，并通過模糊隸屬函數(shù)法對其進行抗旱性綜合評價，以期找出適合威寧地區(qū)種植的茶樹品種，為威寧高山茶產業(yè)的發(fā)展奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶葉種質資源共9份，來源于貴州省畢節(jié)市威寧縣茶產區(qū)，分別是黃金芽、云南大葉茶、鳩坑小葉種、福鼎大白茶、安吉白茶、銀霜、茗科1號、威寧老茶樹、龍井43。種質資源種植于威寧香爐山茶園公司的草海西碼頭茶葉種植基地內(25°35′11″N，104°25′30″E)。種植規(guī)格為行距1.6 m，叢距0.6 m，株距0.25 m，雙行條栽，每叢3株。每個品種種植500株以上，茶苗均為2年生扦插苗，基地生長環(huán)境及人工管理一致。采摘連續(xù)10 d未澆水或未受到雨水灌溉的茶苗葉片進行相關分析測定。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片制作與觀察 隨機選取各茶樹第2～3節(jié)位成熟葉，用徠卡刀片沿葉片主脈中部橫切成0.5 cm×0.5 cm的小塊；放入福爾馬林—醋酸—酒精(FAA)固定液中固定、抽氣。系列酒精脫水各2 h，二甲苯透明，石蠟包埋，徠卡RM2016切片機切片，切片厚度為8～10 μm，番紅—固綠雙重染色，中性樹膠封片[10]。采用日本尼康顯微鏡(Eclipse E100)觀察解剖結構，用尼康自帶拍照軟件(NiknoDS-U3)拍照，并利用Image-pro plus 6.0軟件進行葉片厚度、柵欄組織厚度等指標測定。

1.2.2 抗氧化酶活性測定 隨機選取各茶樹相同部位成熟葉片，用蒸餾水清洗，吸干水分，將葉片剪碎，稱取約0.1 g葉片，加入1 mL磷酸緩沖液(pH 7.5)進行冰浴勻漿。4 ℃ 8000 r/min離心 10 min，取上清液置冰上待測。參照超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒使用說明書操作在酶標儀上測定SOD、POD和CAT值。

1.2.3 滲透調節(jié)物質測定 稱取0.1 g各茶樹葉片樣品，加入5 mL 3%磺基水楊酸，均質化后過濾。取2 mL濾液加入2 mL酸性茚三酮試劑和2 mL冰醋酸，混合均勻，100 ℃下加熱反應1 h，而后在冰上冷卻20 min，放入4 mL甲苯，冷卻至室溫。采用分光光度計法在520 nm測量脯氨酸吸光度值。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[11]。

1.2.4 抗旱性指標評價 采用模糊隸屬函數(shù)值法對9份茶樹種質資源的抗旱性進行綜合評價[12]?？购惦`屬值的計算公式如下。

(1)

(2)

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 18.0 進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，顯著水平設置為α= 0.05，用Microsoft excel 2007進行隸屬函數(shù)分析，相關圖表制作在Origin pro 8中完成。

2 結果與分析

2.1 不同茶樹品種的葉片解剖結構

根據(jù)不同茶樹品種葉片的解剖結構特征(表1，圖1)，9個茶樹品種在葉片厚度、柵欄組織和海綿組織厚度、上下表皮厚度、柵欄組織和海綿組織密度、海綿組織層數(shù)和柵欄組織層及數(shù)柵/海比上都存在差異。9個茶樹品種中，葉片厚度、柵欄組織厚度和柵/海比以鳩坑小葉種的最大，其次是威寧老茶樹和福鼎大白茶，黃金芽和云南大葉茶最小。

表1 不同茶樹葉解剖結構特征

1～9分別為黃金芽、云南大葉茶、鳩坑小葉種、福鼎大白茶、安吉白茶 、龍井43、銀霜 、茗科1號和威寧老茶樹Numbers of 1-9 were the Golden bud tea，Yunnan large leaf tea，Jiukeng small leaf tea，F(xiàn)uding white tea，Anji white tea，Longjing tea 43，Yinshuang tea, Mingke tea 1 and Weining old tea圖1 不同茶樹品種葉片的解剖結構特征Fig.1 Anatomical structure of leaves of different tea cultivars

2.2 不同茶樹品種的抗氧化酶活性

9個茶樹品種間葉片抗氧化酶活性存在一定差異(圖2)。其中，鳩坑小葉種、福鼎大白茶、威寧老茶樹的SOD含量最高，3個品種間差異不顯著，但與黃金芽、云南大葉茶、安吉白茶、銀霜、茗科1號間差異顯著(P<0.05)，黃金芽中SOD含量最低，除與云南大葉茶差異不顯著外，與其他7個茶樹差異顯著(P<0.05)。黃金芽、安吉白茶和龍井43的POD含量最低，3個品種間無顯著性差異，但與其他6個茶樹間差異顯著(P<0.05)；云南大葉茶、鳩坑小葉種、福鼎大白茶、銀霜、茗科1號和威寧老茶樹的POD含量略有不同，但6個茶樹間無顯著性差異。鳩坑小葉種、福鼎大白和威寧老茶樹CAT含量最高，三者無顯著性差異，但與其他6個茶樹差異顯著(P<0.05)；黃金芽、安吉白茶和銀霜的CAT含量最低。

不同小寫字母表示差異達顯著性水平(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level. The same as below圖2 不同茶樹品種的抗氧化酶活性Fig.2 Analysis of antioxidant enzyme content in different tea cultivars

2.3 不同茶樹品種的滲透調節(jié)物質

從圖3看出，9個茶樹品種間葉片滲透調節(jié)物質含量存在差異性。脯氨酸含量以鳩坑小葉種、福鼎大白茶和威寧老茶樹的最高，三者間差異不顯著，與云南大葉茶、安吉白茶、龍井43和茗科1號間均無顯著性差異；黃金芽脯氨酸含量最低，與云南大葉茶和銀霜無顯著性差異，但與其他6個品種間差異顯著(P<0.05)。可溶性蛋白含量以福鼎大白茶的最高，與鳩坑小葉和威寧老茶樹無顯著性差異，與其他茶樹品種間差異顯著(P<0.05)；黃金芽含量最低，與其他8個茶樹品種間差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同茶樹品種的滲透調節(jié)物質含量Fig.3 Osmotic adjustment substances in different tea cultivars

可溶性糖含量以鳩坑小葉最高，與其他8個茶樹品種間差異顯著(P<0.05)，黃金芽含量最低，與其他8個茶樹差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同茶樹品種抗旱性綜合評價

對各指標進行相關性分析，去除相關性較弱的指標，余下葉片厚度、柵欄組織厚度、柵/海、SOD、CAT、POD、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白作為隸屬函數(shù)綜合評價指標，得到綜合評價表(表2)。由綜合評價得出的抗旱性為鳩坑小葉種>威寧老茶樹>福鼎大白>茗科1號>銀霜>安吉大白茶>龍井43>云南大葉茶>黃金芽。根據(jù)抗旱性等級評價的方法[13]，對9個茶樹品種進行抗旱等級劃分，綜合評價均值為0.49，綜合評價值高于0.59的為強抗旱品種，包括鳩坑小葉、福鼎大白和威寧老茶樹；綜合值在0.39～0.59的為中抗旱品種，包括茗科1號和銀霜；綜合值小于0.39的弱抗旱品種，包括安吉白茶、龍井43、云南大葉茶和黃金芽。

表2 不同茶樹隸屬函數(shù)值及抗旱性綜合評價

3 討 論

植物葉片是植物進行光合作用的場所，它的顯微結構受植物生長發(fā)育過程一系列生理活動的影響，與植物的分類和遺傳有密切聯(lián)系[3]。黎釗[3]、楊鳳[4]等研究表明，茶樹葉片的解剖結構與茶樹的抗旱性有一定的相關性，葉片厚度越大的茶樹比葉片厚度小的茶樹抗旱性強，柵/海比大的茶樹比柵/海比度小的抗旱性強。白重炎等[14]研究指出，上表皮厚度、柵欄組織厚度可作為品種間抗旱性指標。本研究中，9個茶樹品種在葉片厚度、柵欄組織和海綿組織厚度、海綿組織和海綿組織密度和柵/海比上表現(xiàn)出一定的差異性，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶的葉片總厚度、柵欄組織厚度和柵/海比上在9個茶樹品種中值最大，黃金芽和云南大葉茶的葉片厚度、柵欄組織厚度和柵/海比最小，表明茶樹間抗旱性存在明顯的遺傳差異，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶在解剖結構上表現(xiàn)出對干旱積極響應。

當植物遭受干旱脅迫時，細胞自由基濃度會迅速增加，細胞透性增大，引起蛋白質變性，細胞受損嚴重[15]。植物體內自由基的清除，主要依賴于SOD、CAT和POD組成的酶保護系統(tǒng)[14]。本研究中，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白的SOD、POD和CAT活性較高，黃金芽和云南大葉茶的SOD、POD和CAT活性較低，表明鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶對干旱脅迫造成的活性氧清除要強于其他茶樹，這與林鄭和等人[16]結果相似。

干旱引起細胞失水，細胞滲透壓降低，引起胞內物質外滲，原生質體結構遭到破壞[15]。滲透調節(jié)物質增加了植物細胞溶質濃度，降低細胞滲透勢，維持較高的滲透壓，緩解了脫水脅迫帶來的傷害，有利于細胞水分的保持和細胞各種生理過程的維持，從而對酶、抗逆性蛋白和生物膜起保護作用[17]。脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物體內常見的滲透調節(jié)物質。本研究中，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于其他茶樹品種，表明3種茶樹遇到干旱時能有效調節(jié)細胞中滲透調節(jié)物質，有效緩解干旱脅迫造成的細胞失水傷害，保證了茶樹的正常生長。

植物耐旱性性狀受多種基因共同調控，分析單個指標無法全面反映植物對干旱脅迫的耐受性[8-12]。利用模糊隸屬函數(shù)值法可以綜合評價茶樹品種的抗旱性，準確性高。本試驗利用隸屬函數(shù)值法綜合評價了9個茶樹品種抗旱性，并根據(jù)抗旱性等級評價的方法對9個茶樹品種進行了等級分類，其中鳩坑小葉、福鼎大白、威寧老茶樹歸為強抗旱品種，茗科1號、銀霜歸為中等抗旱品種，安吉白茶、龍井43、云南大葉茶和黃金芽歸為弱抗旱品種，與生理試驗結果一致。

4 結 論

茶樹抗旱性鑒定是全面系統(tǒng)評價茶樹種質資源和篩選優(yōu)質資源最基本的內容。本研究通過對威寧縣周邊茶區(qū)種植的9個茶樹品種的葉片解剖結構觀察，抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質的測定，并通過模糊隸屬函數(shù)法對9個茶樹品種進行了抗旱性綜合評價，最終篩選出抗旱性較強的3個品種，分別為鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶，為威寧高山茶產抗旱品種的選擇提供了試驗依據(jù)。