蔡金霞，黃明光，胡傳活，張 鑫，梁瑩瑩，紀偉霞，馮 妮，葛晨玲，陳志英，李 珣，王曉曄

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，南寧 530004；2.廣西畜牧研究所，南寧 530001)

【研究意義】養(yǎng)殖場中動物炎癥時有發(fā)生，而炎癥的存在對生殖會產(chǎn)生一定影響，如公畜的睪丸炎會抑制精子發(fā)生和成熟，降低其質(zhì)量和繁殖能力[1]；母畜的乳房炎導致泌乳能力下降，致使幼仔斷奶后成活率降低[2]，嚴重時甚至危及母畜生命，影響其利用價值和使用年限[3-4]。睪丸炎多由細菌感染引起，而脂多糖( Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，可引起動物機體組織和細胞分泌炎性因子，動物體內(nèi)極少量的LPS即可引起廣泛的炎癥反應[5-6]。睪丸支持細胞(Sertoli cells，SCs)是眾多環(huán)境污染物作用于雄性生殖系統(tǒng)最重要的靶細胞，也是動物體內(nèi)和體外試驗中評價雄性生殖系統(tǒng)毒性損傷的良好模型[7]。由于SCs在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，因此任何影響或引起其功能異常的因素均可使精子發(fā)生異常，進而導致不育[8]。他克林是用于治療阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)的第1種藥物，具有很高的脂溶性，容易透過血腦屏障，具有抑制組織中乙酰膽堿酯酶活性、增加乙酰膽堿含量、作為受體激動劑促進乙酰膽堿釋放、促進腦組織對葡萄糖利用而提高記憶力和學習能力及下調(diào)Kv2.1通道表達促進細胞增殖等藥理作用[9]。廣西大學動物科學技術(shù)學院動物解剖實驗室研究發(fā)現(xiàn)，他克林在豬精子液態(tài)保存和冷凍保存方面具有很好的抗凋亡效果[10-11]。但是，目前關(guān)于他克林對雄性動物生殖細胞炎性損傷作用的研究鮮見報道。因此，分析他克林對LPS誘導小鼠睪丸支持細胞(Mouse testis sertoli cells，TM4)炎性損傷的保護作用，可為雄性動物生殖疾病相關(guān)抗炎藥物的利用及精子質(zhì)量提高提供更多藥物選擇?！厩叭搜芯窟M展】Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，0.05、0.10和0.15 mmol/L他克林均可顯著或極顯著提高豬精子的凍后質(zhì)量，其中0.10 mmol/L的處理效果最佳。黃明光等[11]研究表明，他克林對豬精液的常溫和低溫保存具有積極作用，以0.10 mmol/L的處理效果最佳，說明稀釋液中他克林濃度為0.10 mmol/L時能延長豬精子的壽命從而顯著改善其保存效果。SCs具有為生精細胞提供營養(yǎng)、激素轉(zhuǎn)化、屏障隔離和吞噬等功能，外源性化合物對其影響較明顯[12]。已有研究對女貞子多糖在TM4炎性損傷中能量代謝的保護作用進行探討[13]，但炎癥是一個復雜的病理過程，女貞子多糖是否對TM4代謝功能具有直接調(diào)節(jié)作用，或者是通過對其他功能(如免疫功能)的調(diào)節(jié)間接影響代謝功能，還有待進一步探究。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)信號通路是維持組織穩(wěn)態(tài)和防止炎癥病理的關(guān)鍵，與細胞存活和凋亡相關(guān)[14]，TNF是激活核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的主要細胞因子，同時也能誘導細胞凋亡和壞死[15-16]。Pan等[17]研究表明，SCs的免疫豁免特性為細胞、組織和器官的替代治療提供了新思路，當SCs受到LPS刺激后NF-κB信號通路被激活，相應的閉合蛋白表達下調(diào)，SCs細胞表面閉合蛋白內(nèi)化，血睪屏障完整性遭到破壞；腮腺炎病毒感染小鼠睪丸后會誘導TM4中TNF-α、白細胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)蛋白表達上調(diào)，在LPS誘導下，TM4分泌促炎因子TNF-α。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在應用NF-κB抑制劑后，TNF-α和IL-6蛋白分泌減少，暗示NF-κB信號通路對這些細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)他克林對TM4保護作用相關(guān)信號分子(NF-κB、TNF-α和IL-6等基因mRNA和蛋白)表達變化情況的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以TM4為研究對象，從炎癥角度進一步探索他克林對雄性動物生殖相關(guān)細胞的抗炎保護作用，為雄性動物生殖疾病相關(guān)藥物的利用及精子質(zhì)量的提高提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TM4購自武漢普諾賽生物科技有限公司；他克林購自上海相輝醫(yī)藥有限公司；LPS購自美國Sigma公司；DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清購自上海源葉生物科技有限公司；CCK8試劑購自日本同仁化學研究所；IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，引物購自華大基因科技有限公司，NF-κB抗體購自美國Abcam公司。

主要儀器設備：CO2細胞培養(yǎng)溫箱(賽默飛世爾科技有限公司)、倒置顯微鏡(CKX31，奧林巴斯科技有限公司)、細胞計數(shù)板(上海市求精生化有限公司)、96孔板和6 cm2細胞培養(yǎng)皿(廣州潔特生物過濾制品技術(shù)有限公司)、電子分析天平(生物卓精電子科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將TM4置于含有抗生素(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)、5%馬血清(HS)和2.5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[19]。

1.2.2 LPS對TM4增殖的影響 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期TM4，以密度為5×103個/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。小心棄去上清，再加入含不同濃度LPS[0.00(空白組)、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL]的DMEM/F12溶液，分別處理3.0、6.0、12.0和24.0 h后，每孔加入CCK8溶液，用酶標儀于450 nm處測定OD值，并計算細胞增殖率，細胞增殖率大于90.00%表明此濃度的LPS對細胞增殖無明顯抑制作用[3]。將篩選出LPS對TM4損傷的最佳濃度和時間用于后續(xù)試驗。

1.2.3 CCK8法檢測他克林對LPS誘導TM4損傷的保護作用 96孔細胞鋪板方法同1.2.2，后續(xù)操作如下：在上述1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間基礎(chǔ)上，加入含不同濃度他克林的DMEM/F12溶液進行保護。共9組細胞樣品，組1為未加任何藥物的空白組，組2～9分別為先用1.00 μg/mL LPS誘導損傷12.0 h，再用他克林相應濃度(100 000.00、10 000.00、1000.00、100.00、10.00、1.00、0.10和0.01 μg/mL)對細胞進行后處理，每組6個重復孔。放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)分別加入LPS進行前保護處理0.5、1.0、2.0 h和加入LPS進行后保護處理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h后，每孔加入10.0 μL CCK8溶液。CCK8檢測方法同1.2.2。篩選出他克林對LPS誘導TM4損傷保護作用的最佳濃度和時間用于后續(xù)試驗。

1.2.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測IL-6和TNF-αmRNA基因表達情況 試驗分為空白組、LPS組和藥物組共3組，其中，空白組加入DMEM/F12溶液3.0 mL，LPS組加入含LPS的DMEM/F12溶液3.0 mL，藥物組使用1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間處理后，再加入經(jīng)1.2.3篩選出的他克林最佳保護濃度和時間處理的DMEM/F12溶液3.0 mL繼續(xù)培養(yǎng)6.0 h。細胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄按照熒光定量試劑盒說明進行操作，以GAPDH為內(nèi)參基因，分析目的基因的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 TM4炎癥因子表達水平的熒光定量引物序列

1.2.5 ELISA法檢測TM4培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-6蛋白釋放量 按照1.2.4的細胞分組和處理方法提取細胞培養(yǎng)上清中的蛋白樣品，按ELISA試劑盒操作說明進行ELISA檢測。

1.2.6 Western Blot檢測NF-κB蛋白表達 共分析7組細胞樣品，組1為未加入任何藥物的空白組，組2為LPS組(1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間組)，組3為他克林組(1.2.3篩選出的他克林保護濃度和時間組)，組4～7分別為先采用1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間，再用他克林(0.01、1.00、100.00和10 000.00 μg/mL)后處理6.0 h組。以1.2.4中提取的蛋白為目的蛋白，將配制好的一抗(以抗體∶PBST溶液1∶18 000稀釋)進行免疫印跡，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計，以單因素方差分析進行組間差異性顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS對TM4增殖的影響結(jié)果

如表2所示，空白組的TM4增殖情況良好；隨著LPS濃度的升高，100.00 μg/mL LPS誘導處理3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分別為70.00%、66.00%、70.00%和81.00%，均極顯著低于空白組(P<0.01，下同)；隨著LPS處理時間的延長，各濃度LPS誘導處理12.0和24.0 h的TM4增殖率均顯著或極低于空白組(P<0.05，下同)；各LPS濃度及相應誘導時間分別處理的TM4增殖率存在差異，如0.01 μg/mL LPS誘導處理6.0 h的TM4增殖率為110.00%，極顯著高于空白組；而0.10、1.00 μg/mL LPS誘導處理6.0 h的TM4增殖率分別為87.00%和89.00%，極顯著低于空白組；而在所有LPS濃度誘導處理中，1.00 μg/mL LPS誘導處理12.0 h的TM4增殖率最低，為38.00%，極顯著低于空白組。說明隨著LPS濃度的升高和誘導時間的延長，LPS誘導損傷的趨勢逐漸增加，而在不同濃度不同處理時間下，LPS對TM4增殖的影響又存在一定的差異，其中1.00 μg/mL LPS誘導TM4 12.0 h更容易產(chǎn)生炎性損傷。

表2 不同濃度LPS對TM4增殖率的影響

2.2 他克林對LPS誘導TM4損傷的保護作用

如表3所示，10 000.00 μg/mL他克林預處理2.0 h的TM4增殖率為87.00%，顯著低于空白組，10 000.00、100 000.00 μg/mL他克林預處理0.5和1.0 h或后處理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分別為73.00%、68.00%、66.00%、80.00%、81.00%、30.00%、63.00%、75.00%和7.00%、13.00%、29.00%、36.00%、5.00%、15.00%、75.00%、40.00%，均極顯著低于空白組。

表3 不同處理時間、不同濃度他克林對LPS誘導TM4損傷的保護作用(TM4增殖率)

而隨著他克林濃度的降低及時間的延長，如他克林濃度0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL后處理 24.0 h的TM4增殖率分別為117.00%、116.00%、116.00%、114.00%和他克林濃度0.01 μg/mL后處理 6.0 h的TM4增殖率為122.00%，均顯著高于空白組。說明他克林不同濃度、不同處理時間對TM4增殖的影響存在差異，隨著他克林濃度的降低及處理時間的延長，其對TM4的保護作用趨于加強，其中0.01 μg/mL他克林后處理 6.0 h對TM4的保護效果最佳。

2.3 他克林對LPS誘導下TM4 IL-6 和TNF-α基因mRNA表達的影響

如圖1所示，空白組TM4的IL-6(圖1-A)和TNF-α(圖1-B)基因mRNA相對表達量均較低；與空白組比較，LPS組TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相對表達量分別顯著和極顯著上調(diào)；與LPS組比較，藥物組TM4的IL-6基因mRNA相對表達量顯著下調(diào)，TNF-α基因mRNA相對表達量極顯著下調(diào)。說明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相對表達量，從而降低炎癥反應。

#和##分別表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；*和**分別表示與空白組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同Compared with the LPS group，# represented significant difference(P<0.05),and ## represented extremely significant difference(P<0.01).Compared with the blank group,* represented significant difference(P<0.05),and ** represented extremely significant difference(P<0.01).The same as below圖1 他克林對LPS誘導TM4 TNF-α和IL-6基因mRNA表達的影響Fig.1 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.4 他克林對LPS誘導TM4培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6蛋白釋放量的影響

如圖2所示，空白組TM4培養(yǎng)上清的IL-6(圖2-A)和TNF-α(圖2-B)蛋白表達量均較低；與空白組比較，LPS組TM4的培養(yǎng)上清的IL-6和TNF-α蛋白表達量均顯著上調(diào)；與LPS組比較，藥物組TM4培養(yǎng)上清的IL-6和TNF-α蛋白表達量均顯著下調(diào)。說明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α蛋白表達量，從而降低炎癥反應。

圖2 他克林對LPS誘導TM4培養(yǎng)上清TNF-α和IL-6蛋白表達的影響Fig.2 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.5 他克林對LPS誘導TM4 NF-κB蛋白表達的影響

為探究他克林對LPS誘導TM4 NF-κB蛋白表達的影響，采用WB法檢測經(jīng)不同濃度他克林處理不同時間后TM4的NF-κB蛋白表達情況。從圖3-B可看出，與空白組(組1)相比，LPS組(組2)TM4的NF-κB蛋白表達量顯著上調(diào)；與LPS組相比，他克林濃度為1.00(組5)、100.00(組6)和10 000.00 (組7)μg/mL后處理6.0 h可極顯著上調(diào)NF-κB蛋白表達量，而0.01 μg/mL他克林后處理6.0 h(組4)可降低NF-κB蛋白表達量，但差異不顯著(P>0.05)。說明0.01 μg/mL他克林對LPS誘導TM4損傷后處理6.0 h對降低NF-κB蛋白表達量效果不明顯,適當降低他克林濃度或增加保護時間可能效果更佳。

圖3 他克林對LPS誘導TM4 NF-κB蛋白表達的影響Fig.3 Effect of tacrine on NF-κB expression in LPS-induced TM4 cells

3 討 論

他克林是一種西藥，臨床使用始于1993年，是由美國FDA批準上市用于AD治療的第一代藥物之一，具有細胞外老年斑和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)2種病理特征[21]。目前對AD的確切發(fā)病機制尚不清楚，一般認為炎癥、代謝應激和鈣超載等多種因素參與該病的暴發(fā)[22-23]。關(guān)于他克林的研究目前已證實其在AD治療方面效果理想，但長時間高劑量服用存在肝臟毒性，而對其他疾病的治療效果有待進一步驗證[24]。已有研究表明，他克林暴露在表達乙酰膽堿酯酶的細胞(例如神經(jīng)元)中可導致錯誤折疊的乙酰膽堿酯酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚，這種錯誤折疊的酶不能轉(zhuǎn)運到高爾基體/質(zhì)膜，從而導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫及其下游的未折疊蛋白信號級聯(lián)反應[24]。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的協(xié)同作用會增加線粒體膜電位損失，導致暴露于他克林的細胞失去穩(wěn)態(tài)，發(fā)生凋亡。鄭鑫[25]也研究發(fā)現(xiàn)，他克林通過誘導細胞內(nèi)活性氧的過量生成和谷胱甘肽耗竭，誘導HepG2細胞DNA氧化性損傷和斷裂，還誘導HepG2細胞的微核形成增加，說明他克林具有遺傳毒性。已知的他克林不良反應還包括肝毒性[25]和消化道反應，且僅對輕度和中度AD癥狀治療有效，對重度癥狀無效[21]。盡管如此，越來越多的證據(jù)表明，他克林對凋亡和氧化損傷也有一定的保護作用，且可促進細胞增殖[26-29]。此外，他克林對細胞具有一定的增殖作用，其作用機制可能為K+外流減少引起的去極化可增加胞內(nèi)Ca2+濃度，加速細胞增殖[30]，因此，他克林可能對Ca2+增加后的細胞凋亡和氧化應激具有保護作用[9]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，0.01 μg/mL他克林可減少LPS對TM4造成的炎性損傷，而10 000.00和100 000.00 μg/mL他克林呈現(xiàn)一定的細胞毒性，充分說明他克林的細胞毒性和保護性與其濃度相關(guān)；與LPS組相比，藥物組的NF-κB蛋白表達量略低，但差異不顯著，再稀釋10或5倍梯度或者增加保護時間對TM4炎性損傷的保護作用可能更好。

他克林的化學結(jié)構(gòu)是平面、親水性結(jié)構(gòu)，很容易通過血腦屏障，且血腦屏障、血睪屏障和其他血液組織屏障均具有限制水、電解質(zhì)、離子、激素、旁分泌因子和其他外源生物分子的細胞旁(細胞間)和跨細胞擴散的共同特征，產(chǎn)生這些屏障的結(jié)構(gòu)蛋白相似，在功能上也有相似之處[31]。如生物活性肽(F5肽、NC1肽、Lg3肽、Lg4肽和Lg5肽)可能在血腦屏障和其他血液—組織屏障中發(fā)揮作用，這些生物活性肽及其下游信號蛋白也可能影響其他血液—組織屏障的細胞旁和跨細胞藥物擴散[31]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究中他克林對TM4炎性損傷的保護作用機制可能是：①抑制TM4中乙酰膽堿酯酶活性，增加乙酰膽堿含量；②作為TM4中某種受體激動劑，促進乙酰膽堿釋放；③促進TM4對葡萄糖的利用，促進細胞增殖；④減輕TM4凋亡，從而改善炎性損傷。他克林改善TM4炎性損傷的具體機制是否與其對神經(jīng)細胞的作用機制相似，或是否通過穿過血睪屏障產(chǎn)生相應的作用有待進一步探究。

曾有研究發(fā)現(xiàn)，LPS抑制細胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性[32]且炎癥可使IL-6蛋白含量顯著升高[33]，但本研究發(fā)現(xiàn)，LPS抑制細胞活力不僅與抑制濃度和時間關(guān)系密切，且其誘導的TM4中TNF-α和IL-6基因mRNA和蛋白表達量顯著升高，推測他克林能通過調(diào)節(jié)TM4分泌TNF-α和IL-6等炎癥蛋白從而影響炎癥反應。目前對于他克林的探索大多基于他克林的平面、親水性結(jié)構(gòu)進行多功能藥物設計，采用多靶點定向配體方法有望開發(fā)出有效的新藥[34]。基于藥物開發(fā)史上“老藥新用”(由于發(fā)現(xiàn)新的作用機制，而不是增加適應癥)的成功范例，他克林的多重作用及其可能的生理意義值得進一步探討，從而為雄性動物生殖系統(tǒng)疾病的治療乃至精子的生產(chǎn)和保存等提供更多的藥物選擇。

4 結(jié) 論

LPS對TM4增殖產(chǎn)生一定的影響，其中1.00 μg/mL LPS誘導處理12.0 h易于產(chǎn)生TM4炎性損傷；他克林對TM4炎性損傷具有一定的保護作用，其中0.01 μg/mL后處理6.0 h的保護作用最佳，其保護作用可能與IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表達量下調(diào)有關(guān)。