姚麗婷，陳啟智，賴勇州，梁瑜海,2*

1. 華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東 廣州 510642

2. 華南農業(yè)大學，廣東省農業(yè)農村污染治理與環(huán)境安全重點實驗室，廣東 廣州 510642

自養(yǎng)脫氮工藝包括短程硝化和厭氧氨氧化過程，它通過好氧氨氧化細菌(ammonium oxidizing bacteria,AOB)的作用，將部分氨氮氧化成亞硝酸鹽氮，再通過厭氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidizing bacteria,AnAOB)的作用，將剩余的氨氮和亞硝酸鹽氮轉化成氮氣. 與傳統(tǒng)的硝化反硝化工藝相比，自養(yǎng)脫氮工藝可節(jié)省大量曝氣能耗，不需外加有機碳源，脫氮效率高，且污泥產量低，具有非常廣闊的應用前景.但是AnAOB增倍時間長達11 d，生長緩慢，且易流失，難以富集，導致工藝啟動時間長.

為解決此類問題，自養(yǎng)脫氮工藝多采用生物膜法形式，且移動床生物膜反應器(moving bed biofilm reactor, MBBR)是較為理想的選擇之一. MBBR的懸浮填料作為生物膜的載體，AOB先在外層好氧區(qū)利用溶解氧(DO)把氨氮轉化成亞硝酸鹽氮，為AnAOB提供缺氧環(huán)境；在內層缺氧區(qū)，AnAOB利用亞硝酸鹽氮和氨氮轉化成氮氣和少量硝酸鹽氮，由此完成脫氮. MBBR系統(tǒng)主要有兩種，分別為泥膜混合MBBR系統(tǒng)和純膜MBBR系統(tǒng). 其中，純膜MBBR系統(tǒng)只有懸浮填料，沒有懸浮態(tài)污泥；而泥膜混合MBBR系統(tǒng)結合了活性污泥法和生物膜法的優(yōu)點，得到了廣泛的應用. 采用泥膜混合MBBR系統(tǒng)可強化自養(yǎng)脫氮微生物的富集過程，以期減少自養(yǎng)脫氮工藝啟動時間.

目前，MBBR自養(yǎng)脫氮的啟動研究中，接種污泥多是來自穩(wěn)定運行的一體式自養(yǎng)脫氮反應器(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite, CANON). 如呂愷等通過接種CANON的生物膜(填充率為25%)，構建序批式泥膜混合MBBR系統(tǒng)，在DO濃度為0.4～0.7 mg/L的條件下，經過115 d成功啟動CANON工藝并穩(wěn)定運行；周家中等通過動態(tài)流接種CANON污泥，在泥膜混合MBBR系統(tǒng)中，經過70 d成功啟動CANON工藝. 這些研究中接種的CANON污泥都較難獲得. 筆者在序批式短程硝化絮狀污泥反應器中，投加含有少量AnAOB的懸浮填料，構建泥膜混合MBBR系統(tǒng)，嘗試啟動自養(yǎng)脫氮工藝，并對啟動前后的絮狀污泥樣品和填料生物膜樣品進行高通量測序，分析該系統(tǒng)中不同時期絮狀污泥和填料生物膜的微生物特征，以期為自養(yǎng)脫氮工藝的啟動及宏觀調控提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置及工藝流程

如圖1所示，MBBR有效體積為20 L，由圓柱形的塑料桶、曝氣裝置、攪拌器和抽水泵組成. 接種短程硝化絮狀污泥，投加無明顯厭氧氨氧化活性的懸浮填料(含有少量AnAOB)，填充率為20%. 該試驗運行93 d，進水為人工配水. 根據水質情況分為兩個階段：階段Ⅰ為第1～56天，進水中含有200 mg/L的NH-N和100 mg/L的NO-N；階段Ⅱ為第57～93天，進水只有200 mg/L的NH-N. 每個階段都添加NaHCO，提供堿度和無機碳源.

圖 1 MBBR裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the MBBR

MBBR以序批式模式運行，51 d前，其運行周期包括進水、反應、沉淀、排水、閑置5個階段，其中反應階段包括曝氣和攪拌，攪拌結束后采集水樣作為出水. 第51天后，探討了缺氧時間對厭氧氨氧化反應的影響，增加靜置階段，靜置結束后采集水樣作為出水，其運行周期包括進水、反應、沉淀、排水4個階段，一個周期為24 h，其中反應階段包括曝氣+攪拌、缺氧攪拌和靜置，具體情況如表1所示. 試驗在室溫(20～30 ℃)下運行，進水pH為7.8～8.2，DO濃度為0.2～0.9 mg/L.

1.2 分析測試方法和計算方法

NH-N、NO-N、NO-N濃度均采用UV-1800型紫外/可見光分光光度計 (上海美譜達儀器有限公司)測定，其中NH-N濃度用納氏試劑分光光度法測定，NO-N濃度用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定，NO-N濃度用紫外分光光度法測定，pH和DO濃度采用Multi3630便攜式多參數測定儀(德國WTW公司)測定. 氨氧化率(ammonia oxidation rate,AOR)、亞硝酸鹽氮積累率(nitrite accumulation rate,NAR)和TN去除率(nitrogen removal rate, NRR)分別按照式(1)～(3)計算.

表 1 自養(yǎng)脫氮工藝運行情況Table 1 Operation of the autotrophic nitrogen removal process

式中：(NH-N)、(NH-N)分別為進、出水的NH-N質量濃度，mg/L；(NO-N)、(NO-N)分別為進、出水的NO-N質量濃度，mg/L；(NO-N)、(NO-N)分別為進、出水的NO-N質量濃度，mg/L；(TN)、(TN)分別為進、出水的TN質量濃度，mg/L.

1.3 污泥的微生物特征分析

在運行的第1天和第93天，從MBBR中獲取污泥樣品. 將污泥樣品置于50 mL無菌塑料試管中，并于-20 °C保存，后送至生工生物工程(上海)股份有限公司，進行DNA提取和高通量測序. 測序區(qū)域為細菌16S rRNA的V3～V4區(qū)域，PCR擴增引物采用341F/805R(341F為CCTACGGNGGCWGCAG，805R為GACTA CHVGGTATCTAATCC). 所得序列用uclust(uclustv1.1.579)進行聚類分析，將相似度97%定義為操 作 分 類 單元(operational taxonomic unit，OTU). 用Mothur(http://www.mothur.org)計算Shannon-weiner指數，采用Silva(http://www.arb-silva.de)進行比對.

2 結果與討論

2.1 MBBR運行性能分析

階段Ⅰ中，第1～44天的短程硝化過程穩(wěn)定，平均AOR為57.88%，且NAR穩(wěn)定在97%以上. 這可能是因為進水游離氨(free ammonia, FA)濃度(15～25) mg/L較高，有效地抑制了亞硝酸鹽氧化菌(nitrite oxidation bacteria, NOB)的活性. 由于運行初期AOR較高，導致MBBR中NH-N和NO-N的比例失衡，第28～56天的曝氣時間減至1.75 h.

由圖2(a)(c)(d)可知，第45天，AOR和NRR分別增至71.31%和26.83%，同時有8.48 mg/L的NO-N產生. 第45～56天，NO-N濃度變化值與TN損失的比值(ΔNO-N/ΔTN)平均為0.113，與式(4)計算的理論值(0.125)較為接近. 這表明MBBR中發(fā)生了厭氧氨氧化反應. 而ΔNO-N/ΔTN低于理論值，說明厭氧氨氧化反應生成的部分NO-N被內源反硝化消耗.

階段Ⅱ的進水不再額外投加NO-N，厭氧氨氧化反應所需的NO-N由短程硝化提供. 第57～68天的厭氧氨氧化作用大幅提高，平均NRR提高至61.99%.其中在第57～59、66、69天分別測定了進水、曝氣階段結束出水、反應階段結束出水的3種氮素濃度，得出曝氣階段(從進水到曝氣階段結束)和缺氧階段(從曝氣階段結束到反應階段結束)的氮素濃度變化值. 以ΔNH-N、ΔNO-N、ΔNO-N分別表示每個階段NH-N、NO-N和NO-N的濃度變化. 由表2可知，第57～59、66、69天曝氣階段ΔNH-N和ΔTN的平均值分別為114.44、23.91 mg/L，說明曝氣階段主要發(fā)生短程硝化反應、少量的厭氧氨氧化和內源反硝化反應. 對于靜置缺氧階段，ΔTN的平均值為103.08 mg/L，而ΔNH-N:ΔNO

圖 2 運行期間NH4+-N濃度、NO2--N濃度、NO3--N濃度、TN濃度、AOR、NAR和NRR的變化Fig.2 Changes of NH4+-N concentration, NO2--N concentration, NO3--N concentration, TN concentration, AOR, NAR and NRR during operation

-N:ΔNO-N的平均值為1:1.43:0.25，接近厭氧氨氧化的理論比值(1:1.32:0.26)，說明缺氧階段主要發(fā)生厭氧氨氧化反應和少量內源反硝化反應. 而曝氣階段只有少量厭氧氨氧化反應，這主要是生物膜厚度還不夠，氧氣能通過外側的好氧層，抑制厭氧氨氧化反應.

表 2 第57～59、66、69天氮素平均濃度的變化Table 2 The change values of nitrogen on days 57th to 59th,66th and 69th

因此，第69～93天進一步調整運行模式，曝氣量從25.0 L/min逐步減至8.3 L/min，DO濃度降至0.4 mg/L左右，曝氣時間從1.75 h逐步增至3.75 h，促進AOB和AnAOB在曝氣階段同時反應. 維持AOR在50%左右，繼續(xù)在缺氧階段為AnAOB提供適宜比例的基質. 該階段自養(yǎng)脫氮效果逐漸提高，平均NRR從60%逐漸提高至70%.

在泥膜混合MBBR系統(tǒng)中，接種的短程硝化絮狀污泥既能保證短程硝化的穩(wěn)定進行，又為AnAOB的富集提供了基質與保護作用. 在第45～93天，自養(yǎng)脫氮工藝穩(wěn)定運行，曝氣階段主要進行短程硝化，厭氧氨氧化反應主要發(fā)生在缺氧階段，平均NRR達到62.24%.

2.2 泥膜混合MBBR系統(tǒng)中微生物的特征

微生物多樣性

在微生物特征分析中共有4個樣品，Rs0為初始絮狀污泥、Rs1為第93天絮狀污泥、Rb0為初始接種填料生物膜、Rb1為第93天填料生物膜. 如圖3所示，Rs0、Rs1、Rb0、Rb1的OTU數量分別為504、594、562、620. 運行后期絮狀污泥和生物膜樣品的OTU數量增加，說明泥膜混合MBBR系統(tǒng)在啟動自養(yǎng)脫氮工藝的過程中，促進了微生物富集，使得該系統(tǒng)中微生物的種類數量提升.

圖 3 樣品的OTU分布Venn圖Fig.3 Venn diagram of OTU distribution of samples

圖 4 樣品中微生物的Shannon-Weiner指數曲線Fig.4 Curve of Shannon-Weiner index of microorganisms in sample

由圖4可 知 ，Rs0、Rs1、Rb0、Rb1的Shannon-Weiner指數分別為2.73、3.51、2.51、3.21. 運行后期，泥膜的Shannon-Weiner指數較大，說明采用泥膜混合MBBR系統(tǒng)可提高MBBR內的生物多樣性，這與OTU分析結果符合. 但是對比同時期絮狀污泥和填料生物膜Shannon-Weiner指數的大小(Rs0＞Rb0, Rs1＞Rb1)，發(fā)現其與OTU分析結果(Rs0＜Rb0, Rs1＜Rb1)正好相反. 這種差異是由于樣品中微生物種群的均勻程度不同造成的. Shannon-Weiner指數是綜合考慮物種種類數量和均勻度的指標. 填料生物膜的外層和內側存在環(huán)境差別，分別生長著不同的微生物，最終顯示出較高的不均勻性，所以綜合計算時填料生物膜的Shannon-Weiner指數較小.

微生物群落結構分析

從門分類水平對微生物特征進行分析，由圖5(a)可知，Rs0、Rs1、Rb0、Rb1中Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)的相對豐度均較大. 擬桿菌門是化能有機營養(yǎng)菌，可以降解多種復雜有機物，廣泛存在于活性污泥系統(tǒng)中. 由于該試驗不投加有機碳源，MBBR運行后期，填料生物膜的擬桿菌門相對豐度由64.75%降至32.35%. 變形菌門是污水處理系統(tǒng)中活性污泥的重要組成部分，與生物硝化作用和有機物降解有關. 大多數與脫氮相關的功能菌都屬于變形菌門. 浮霉菌門是AnAOB所在的菌門，Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中浮霉菌門相對豐度分別為0.96%、13.06%、9.56%、30.77%，運行后期浮霉菌門的相對豐度都有所增加，其中填料生物膜中浮霉菌門的相對豐度增幅較大. 綠彎菌門是厭氧氨氧化系統(tǒng)中常見的菌門，綠彎菌門可分解死亡的AnAOB，且它的絲狀結構有利于生物膜的形成. Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中綠彎菌門相對豐度分別為2.73%、2.45%、4.03%、7.04%，運行后期綠彎菌門相對豐度有所增加，且填料生物膜中綠彎菌門的相對豐度較大，可見綠彎菌門對于厭氧氨氧化和生物膜系統(tǒng)具有重要作用.

圖5(b)為屬水平的微生物特征，Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中AOB的優(yōu)勢菌屬均為，相對豐度分別為42.95%、6.85%、30.98%、3.97%. 運行后期的相對豐度都有所減少，這是因為是r-對策者，底物親和力較低，適合在高濃度DO條件下生長. 而啟動過程中控制DO濃度，導致的相對豐度降低. 已有研究表明，AOB在填料上生態(tài)位的競爭中處于劣勢. 運行后期，絮狀污泥中的相對豐度比填料生物膜中較高，說明AOB主要分布在絮狀污泥中，這是由于氧氣在絮狀污泥中的傳質阻力小于生物膜.另外，泥膜混合MBBR系統(tǒng)中還檢測出一種兼性好氧異養(yǎng)菌，該菌可以利用NH-N進行異養(yǎng)硝化反應. Rs0、Rb0、Rs1、Rb1中的相對豐度分別為0.27%、2.75%、1.00%、2.40%. 運行過程中，的相對豐度變化不大，說明泥膜混合MBBR系統(tǒng)中短程硝化可能是由AOB和異養(yǎng)硝化細菌合作完成的. 泥膜混合MBBR系統(tǒng)中唯一檢出的NOB菌屬是，的相對豐度在所有污泥樣品中都小于0.05%，說明了NOB被有效地抑制.

圖 5 不同階段門水平和屬水平上微生物的相對豐度Fig.5 Relative abundance of microorganisms at Phylum level and Genus level with different stages

泥膜混合MBBR系統(tǒng)中檢出的AnAOB菌屬總共有3種，分別為、、，其 中的相對豐度在所有樣品中都很小，在0.005%左右. 在絮狀污泥中，初始時和的相對豐度為0.01%和0%，運行后期相對豐度分別增至4.72%和0.12%. 這說明接種的短程硝化絮狀污泥中幾乎沒有AnAOB，在自養(yǎng)脫氮工藝成功啟動后，絮狀污泥中含有少量的，而變化不大. 在填料生物膜中，初始時和的相對豐度分別為4.05%和1.82%，運行后期相對豐度分別為25.75%和0.14%. 這表明在接種填料生物膜上存在少量的AnAOB，隨著反應的進行，_的相對豐度大大升高，成為泥膜混合MBBR系統(tǒng)中AnAOB的優(yōu)勢菌屬，而的相對豐度遠低于前者. 有研究表明，在特定環(huán)境條件下啟動成功的自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)內只有一種AnAOB會成為優(yōu)勢菌屬，這與該研究的結果類似. 此外，運行后期的填料生物膜中，AnAOB的相對豐度較高，說明AnAOB主要分布在填料生物膜中.

泥膜混合MBBR系統(tǒng)中還檢出、、、、、、等反硝化菌屬. 其中，都屬于好氧反硝化菌，已有研究表明，能夠與AnAOB共生，保護AnAOB免受氧氣和有機物的抑制. 運行后期，填料生物膜中的相對豐度由54.57%降至23.89%，該菌含有氧化一氮和一氧化二氮還原酶的基因，可進行反硝化反應.運行后期，填料生物膜中反硝化菌的相對豐度較高，說明泥膜混合MBBR系統(tǒng)中部分TN損失是由內源反硝化貢獻的.

綜上，自養(yǎng)脫氮工藝成功啟動后，泥膜混合MBBR系統(tǒng)中絮狀污泥和填料生物膜中均存在AOB和AnAOB，但兩類菌群分布規(guī)律并不相同，主要分布在絮狀污泥中，而則主要分布在填料生物膜中. 這說明在泥膜混合MBBR系統(tǒng)中絮狀污泥和填料生物膜各司其職，分別完成短程硝化和厭氧氨氧化反應.

3 結論

a) 在短程硝化絮狀污泥反應器中投加懸浮填料，構建泥膜混合MBBR系統(tǒng)，在溫度為20～30 ℃、進水pH為7.8～8.2、DO濃度為0.2～0.9 mg/L的條件下，經過45 d，成功富集了AnAOB，成功啟動厭氧氨氧化反應. 曝氣階段主要發(fā)生短程硝化，曝氣結束后的缺氧階段主要發(fā)生厭氧氨氧化和少量內源反硝化反應，平均NRR達到62.24%.

b) 泥膜混合MBBR系統(tǒng)中，AOB主要分布于絮狀污泥中，而AnAOB主要分布于填料生物膜中. AOB的優(yōu)勢菌屬為，AnAOB的優(yōu)勢菌屬為.

c) 運行后期的填料生物膜中存在反硝化細菌，泥膜混合MBBR系統(tǒng)中部分TN損失是由內源反硝化貢獻的.