羅強軍 劉春霞 柴翠翠 林婧 張紅良

摘要：目的：對甘肅省少數(shù)民族地區(qū)不同民族433例血液標本進行RH（C/c/E/e）、Lewis（Lw/Lw）、Duffy（Fy/Fy）等12種紅細胞血型基因檢測分析，為我省少數(shù)民族血液學研究、臨床輸血安全及稀有血型庫建設等提供數(shù)據支撐，應用于精準輸血醫(yī)學。方法：對433例標本用熒光PCR法進行血型基因檢測分析和統(tǒng)計，使血型基因分型應用于精準輸血醫(yī)學。結果：多數(shù)表型各民族間符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0.05），無統(tǒng)計學意義；CC、MN頻率：回族>其他>漢族；Cc、Ee頻率：漢族>其他>回族；Kell、Colton、Dombrock、Yt血型系統(tǒng)中，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+均為：其他>回族>漢族，且漢族中未發(fā)現(xiàn)Coa+b+、Yta+b+兩種表型，經過χ2值運算民族之間具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：甘肅省少數(shù)民族地區(qū)人群RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dombrock血型系統(tǒng)抗原基因頻率呈多態(tài)性分布，Lw、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+民族之間存在著差異（P<0.05），有統(tǒng)計學意義。

關鍵詞：紅細胞血型；血型抗原；血型基因；基因分型；RhEC；精準輸血

中圖分類號：R55文獻標志碼：A

血型是分布在紅細胞膜上的特異性抗原，是人類的重要遺傳標志，具有遺傳多態(tài)性，在臨床輸血安全性中發(fā)揮著決定性作用。1900年ABO血型的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了免疫血液學（Immunohematolgy），開啟了輸血醫(yī)學先河；隨著分子生物學技術發(fā)展，血型檢測已進入了后基因組時代，即血型基因組學（Blood group genomics）[1]。截至2021年2月，國際輸血協(xié)會（International Society Blood Transfusion ISBT）發(fā)現(xiàn)并命名的紅細胞血型系統(tǒng)有43個，共343個抗原，部分紅細胞血型抗原在人群中的分布頻率小于1%，稀有血型患者存在巨大的生存危機，即當需要輸血治療時不易找到相容的血液，當找不到相容血液時，可能會引發(fā)溶血性輸血反應或新生兒溶血病等，出現(xiàn)溶血、孕婦早產等癥狀，嚴重者導致患者死亡。對人群進行血型篩查，特別是部分少數(shù)民族，其可能具有獨特的遺傳特征，在少數(shù)民族地區(qū)建立紅細胞稀有血型數(shù)據庫，為臨床選擇配合型血液輸注提供依據，同時可以有效避免上述情況的發(fā)生。紅細胞血型基因多態(tài)性的研究在精準輸血醫(yī)學（Precision transfusion medicine）中扮演著重要角色[2-3]。國內對少數(shù)民族人群稀有血型研究甚少，其可能具有獨特遺傳特征，為探討少數(shù)民族人群紅細胞的RhCE、Lw、Duffy、Kidd、MNS、Scianna、Colton、Dombrock、Kell、Diego、Yt和Lutheran血型系統(tǒng)基因頻率分布情況，本研究采用熒光PCR技術對433例甘肅省少數(shù)民族地區(qū)人群血型基因進行檢測分析，調查自治區(qū)人群12個稀有血型系統(tǒng)抗原基因頻率及表現(xiàn)型頻率的分布特點，為紅細胞稀有血型庫建設等方面提供一定的數(shù)據支持，同時為該少數(shù)民族人群制定個體化的輸血治療方案提供依據，并提高輸血的安全性和精確性。

1對象和方法

1.1研究對象

收集2017年5月至2019年6月甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉(xiāng)族撒拉族自治縣人群標本433例，其中回族195例，漢族149例，其他89例（包括東鄉(xiāng)族71例，撒拉族7例，藏族5例，保安族4例，土族1例，布依族1例），采用EDTA抗凝真空管采集標本2～3 mL，進行血型基因檢測，原始數(shù)據及檢測記錄完整。本研究已征得蘭州大學第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑

血型基因檢測、DNA提取等實驗所需試劑盒：人類紅細胞稀有血型基因分型檢測試劑盒（江蘇中濟萬泰生物醫(yī)藥有限公司，批號20180819）；熒光PCR儀（德必基生物科技（廈門）有限公司，型號TBG一Q6000，DNA提取試劑盒廠家TBG，批號C011712R0）；醫(yī)用低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，Mini一10K）；臺1式冷凍離心機（久保田公司，S700TR）；紫外分光光訓度計（Merinton，SMA4000）；核酸純化儀（杭州博日科技有限公司，NPA32P）；漩渦混勻器（金壇區(qū)白塔新寶儀器廠，XH-T）。

1.3檢測方法

對32種臨床重要的紅細胞抗原基因設計專一性引物，結合SYBR Green I進行實時熒光PCR擴增及熔解曲線反應，詳細見圖1，當引物序列與待測序列互補時，通過PCR反應將目的片段復制與放大，再通過熔解曲線的熒光信號與溫度變化，檢測特異性產物在雙鏈解離50%時的溫度（Tm）。PCR體系中加入內參（IC），用于評估樣本質量及PCR抑制因素。按照人類紅細胞稀有血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）（江蘇中濟萬泰生物醫(yī)藥有限公司）的說明書操作步驟進行基因分型。首先配制反應液，加入PCR濃縮液管中，與工作液混勻。每孔加樣10μL，封膜后置入96孔板進行PCR擴增和熒光檢測。以熒光PCR軟件開啟數(shù)據，利用陽性、陰性的Tm判斷值范圍找出陽性的孔。結合型別判讀表，直接判讀陽性陰性結果1。

1.4統(tǒng)計分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。結果以頻率、構成比指標表達，計量資料以3組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，以P<0.05表明具有顯著性差異并且有統(tǒng)計學意義

2結果

（1）該地區(qū)RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dom？ brock血型系統(tǒng)抗原基因頻率呈多態(tài)性分布，Lw、Scian？ na、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布。

甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉(xiāng)族撒拉族自治縣人群進行12種血型系統(tǒng)基因檢測，433例標本中等位基因頻率分布為：C=0.7875，c=0.6097，E= 0.4919，e=0.9053，Lwa=0.9977，Lwb=0，F(xiàn)ya=0.9954，F(xiàn)yb= 0.1963，Jka=0.7344，Jkb=0.7783，M=0.7344，N=0.6074，S= 0.097，s=0.9053，Mur=0.0116，SC（-1，p2）=0，Dia=0.06，Dib=1.0000，Wra=0.0046，Wrb=0.8614，K=0，k=0.9977，Kpa=0.0323，Kpb=1.0000，Coa=1.0000，Cob=0.0092，Doa= 0.254，Dob=0.9815，Lua=0.2009，Lub=1.0000，Yta=1.0000，Ytb=0.023；其中等位基因頻率分布狀況，RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dombrock血型系統(tǒng)抗原基因頻率呈多態(tài)性分布，Lw、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布。其中等位基因c頻率分布：漢族>其他>回族；等位基因N頻率分布：其他>漢族>回族；等位基因Kpa、Coa、Cob、Doa均為其他>回族>漢族，且漢族中未發(fā)現(xiàn)等位基因Cob；c、N、Kpa、Coa、Cob、Doa等位基因的頻率在漢族和少數(shù)民族之間存在一定的差異，且均為P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。等位基因Lwb、SC（-1，p2）、K頻率各民族均為0，等位基因Cob漢族中也未檢測到，等位基因Dib、Kpb、Coa、Lub、Yta頻率各民族均為100%，除以上七種外其他的等位基因在各民族之間差異符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0，05），無統(tǒng)計學意義。見表1所列。

（2）該地區(qū)罕見血型表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+民族之間存在著差異。

通過對甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉(xiāng)族撒拉族自治縣人群12種稀有血型系統(tǒng)抗原基因40種表型頻率分布的Hary-Weinberg吻合度檢驗，其中29種表型各民族間符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0，05），無統(tǒng)計學意義。CC、MN頻率：回族>其他>漢族；Cc、Ee頻率：漢族>其他>回族；Kell、Colton、Dombrock、Yt血型系統(tǒng)中，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+均為：其他>回族>漢族，且漢族中未發(fā)現(xiàn)Coa+b+、Yta+b+兩種表型，經過χ2值運算這幾種表型均為P<0.05，民族之間存在著差異，均有統(tǒng)計學意義，可能由于少數(shù)民族起源、居住環(huán)境相對隔離、宗教信仰、通婚習俗及人群遷徙等因素的影響，使得部分血型表型具有自身的遺傳特征，這對人類遺傳學的研究具有重要的意義。具體數(shù)據見表2所列。

3討論

本研究通過對甘肅省少數(shù)民族地區(qū)人群12種稀有血型系統(tǒng)抗原基因分布頻率進行χ2檢驗，多數(shù)血型系統(tǒng)符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0.05），其中抗原C、c、E、e的抗原陽性頻率分別為：78.75%、60.97%、49.19%、90.53%（表3），這與丁佳棟[4]“蘭州地區(qū)獻血員Rh血型抗原及RhCE基因分布”結果類似，但對于部分罕見抗原如：S、Kpa、Cob、Lua的抗原頻率分布在民族之間存在差異，少數(shù)民族抗原陽性比例明顯高于漢族，且之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?？乖蝾l率分布分析發(fā)現(xiàn)：RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dom？ brock血型系統(tǒng)基因頻率呈多態(tài)性分布；Lewis、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統(tǒng)呈單態(tài)性分布；Kell、Colton、Yt血型系統(tǒng)中，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+中，少數(shù)民族均高于漢族（表4），且漢族中未發(fā)現(xiàn)Coa+b+（χ2=7.572，P=0.023）和Yta+b+（χ2=7.709，P=0.021）兩種表型，經過χ2值運算這幾種表型均為P<0.05，有統(tǒng)計學意義。

甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉(xiāng)族撒拉族自治縣是甘肅省唯一的多民族自治縣，居住環(huán)境相對隔離，民族間有各自獨立的宗教信仰與通婚習俗，具有自身的遺傳特征，特別是少數(shù)民族中罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+占比均高于漢族，說明漢族血型基因有著高度集中性，更接近于亞裔黃種人基因分布特征，因而血型系統(tǒng)基因遺傳相對穩(wěn)定[5-7]，其與國內的其他地區(qū)少數(shù)民族相比較也存在差異，因此不同地區(qū)、民族和人群中存在著一定的相同性和差異性[8-13]。這對人類遺傳學的研究具有重要的意義。

人類紅細胞血型的表型和基因型在遺傳學上存在個體差異，各民族之間也有一定的差異性，由于血型分布與人種以及種族群體相關，此次研究對于甘肅省少數(shù)民族地區(qū)人群紅細胞血型遺傳背景及甘肅省稀有血型數(shù)據庫的建設提供依據不同的血型抗原具有遺傳多態(tài)性，不同民族或地區(qū)間具有一定的差異性。[14]輸血可以挽救患者生命，但輸血治療引起的同種異體免疫反應也會威脅患者的生命安全。[8]在患者隨機輸血或妊娠免疫刺激時，一些稀有血型抗原不一定完全匹配，可能會從產生抗體，導致輸血不良反應，新生兒溶血病和免疫性疾病。[11]精準醫(yī)學的基本概念是考慮到個體差異后所實施的預防診斷和治療策略，對有輸血史、妊娠、組織器官移植等同種免疫作用產生血型抗體患者的輸血（如常見的有抗E、抗C/c、抗EC、抗S/s、抗M/N、抗K、抗Mur、抗Fy等），甚至還發(fā)現(xiàn)由抗-Fy、抗k，抗C聯(lián)合抗體[15-17]，給輸血帶來極困擾，需要個體化處理，輸注相應抗原陰性的血液[14]。因此，調查地區(qū)性人群多種紅細胞血型系統(tǒng)基因頻率分布特點，建血型基因型數(shù)據庫[18]，為患者提供與大多數(shù)免疫性抗原相容的血液成分，對稀有血型患者選擇配合型血液輸注、指導臨床科學合理用血、提高血液資源有效利用，及預防新生兒溶血具有重要意義，且能達到精準輸血的目的[19]。

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