王君 朱旭江孫亞紅 張曉霞 任鳳嬌陳虎虎

1.麗彩甘肅西峰制藥有限公司，甘肅 慶陽(yáng) 745000；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070；3.隴東學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000

重感靈片處方由毛冬青、羌活、葛根、石膏、馬鞭草、板藍(lán)根、青蒿、馬來(lái)酸氯苯那敏、安乃近共7味中藥材和兩味化學(xué)藥品組成［1-2］。一直以來(lái)重感靈片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS-10872（ZD-0872）-2002-2011Z），其含量測(cè)定項(xiàng)僅測(cè)定其中安乃近成分［3］，現(xiàn)已有研究報(bào)道［4］測(cè)定本品中馬來(lái)酸氯苯那敏含量，但其中的中藥材成分含量卻未做測(cè)定，不能夠全面控制重感靈片質(zhì)量。經(jīng)通方分析，重感靈片中的葛根在方解中具有退熱，透疹，生津止渴，升陽(yáng)止瀉的功效，對(duì)于感冒引起的表證發(fā)熱、項(xiàng)背強(qiáng)痛、麻疹不透、熱病口渴、脾虛泄瀉、熱瀉熱痢等效果明顯，而上述癥狀是重感靈片的主要適應(yīng)證。因此，為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品功效，以中藥葛根中的有效成分葛根素作為產(chǎn)品的控制指標(biāo)。筆者借鑒諸多高效液相色譜法在藥品含量檢測(cè)中的運(yùn)用實(shí)例［5-8］，采用HPLC法測(cè)定其中葛根素的含量作為重感靈片質(zhì)量又一控制方法，并進(jìn)行合理性驗(yàn)證，對(duì)重感靈片用量較大的葛根進(jìn)行質(zhì)量控制，以期為提高重感靈片的質(zhì)量控制的研究提供思路和參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Discovery分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；WB500CD型數(shù)控超聲波清洗儀（上海望標(biāo)儀器有限公司）。

1.2 試劑、試藥 對(duì)照品：葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752-200912）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；供試重感靈片（批號(hào)：703072、704094、706079）：甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司；甲醇：色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司；其他試劑：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件的確定 分別考察不同型號(hào)色譜柱、有機(jī)相、組成比例、流量等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選用CAPCELL PAK C18（4.6mm×250mm，5m）色譜柱；流動(dòng)相以甲醇-水（體積比為22∶78）；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10μL，色譜峰出峰時(shí)間合適，相鄰峰之間分離度符合要求。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加稀乙醇至刻度，制成質(zhì)量濃度為每1mL含0.1mg的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備 考慮葛根素含量指標(biāo)以及雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定的影響基礎(chǔ)上，對(duì)制備供試品溶液時(shí)的提取溶劑、方法、時(shí)間等方面的制備方法進(jìn)行考察。分別采用稀乙醇回流30min、稀乙醇超聲30min、稀乙醇索氏提取等方法對(duì)樣品進(jìn)行提取，結(jié)果測(cè)得稀乙醇回流30min處理的樣品中葛根素的含量較高，雜質(zhì)對(duì)測(cè)定影響較小。進(jìn)一步對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，分別采用稀乙醇回流20min、30min、40min、1h處理樣品，結(jié)果測(cè)得稀乙醇回流20min結(jié)果優(yōu)于其他提取時(shí)間。

最終供試品的制備方法為：取重感靈片約0.5g，研細(xì)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加稀乙醇100mL，密塞，稱定重量，加熱回流20min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含葛根的陰性樣品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3 結(jié)果

3.1 陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 將上述2.4項(xiàng)下的陰性對(duì)照溶液10μL注入液相色譜儀，在與供試品相同條件下記錄色譜峰的流出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1（C）所示，陰性對(duì)照在與葛根素對(duì)照品保留時(shí)間相同位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明重感靈片中其他組成成分及輔料對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》中相關(guān)原則要求，對(duì)系統(tǒng)適用性進(jìn)行驗(yàn)證。分別量出供試品色譜峰流出曲線中葛根素及相鄰峰的峰寬與保留時(shí)間，如圖1（B）所示，按公式R＝2（tR2-tR1）/（W1+W2）進(jìn)行分離度計(jì)算，結(jié)果為1.6，符合測(cè)定要求。

圖1 高效液相色譜圖（A）葛根素對(duì)照品；（B）供試品；（C）陰性對(duì)照

對(duì)色譜柱的理論板數(shù)進(jìn)行考察，分別量出供試品色譜峰流出曲線中葛根素峰半峰寬與保留時(shí)間，按公式n＝5.54（tR/W0.5h）2＝3183，規(guī)定色譜柱的理論板數(shù)（n）應(yīng)不低于1500。

對(duì)色譜峰的拖尾因子進(jìn)行考察，如圖1（B），分別量出供試品色譜峰流出曲線中葛根素峰0.05峰高處的峰寬與峰極大至峰前沿之間的距離，按公式T＝W0.05h/2d1進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算得到T＝1.02，在0.95～1.05之間，符合測(cè)定要求。

3.3 進(jìn)樣精密度 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液10μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值，RSD為0.94%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 工作曲線與線性范圍 精密吸取對(duì)照品溶液4、6、8、10、12、15、20μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量（μg）為縱坐標(biāo)（Y）作圖，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝2.9109×10-7X+0.0841，相關(guān)系數(shù)為R＝0.9993。結(jié)果表明，葛根素在0.406μg～2.03μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

3.5 重復(fù)性 取批號(hào)為704094供試品6份，研細(xì)，每份約0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別精密加稀乙醇100mL，按“2.3”項(xiàng)下供試品的制備方法制備，然后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定的重復(fù)性結(jié)果（n=6）

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為704094供試品1份，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，然后分別于0、1、2、4、6、8h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄測(cè)定待測(cè)成分峰面積積分值，其RSD值為1.56%，表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品（批號(hào)：703072）6份，研細(xì)，每份約0.3g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別精密加稀乙醇100mL及一定量的葛根素對(duì)照品溶液（0.1913mg/mL），密塞，稱定重量，加熱回流20min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算總含量，再減去樣品中葛根素量，其差值除以加入的相應(yīng)對(duì)照品量，得回收率。計(jì)算所得的平均回收率（%）及RSD（%）見(jiàn)表2。

表2 葛根素含量加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

結(jié)果表明，本方法測(cè)定重感靈片中葛根素含量的樣品回收率為95.11%～99.47%，RSD為1.60%，表明本方法的準(zhǔn)確度較高。

3.8 樣品含量測(cè)定 取供試重感靈片（批號(hào)：703072、704094、706079）樣品各3批，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備及“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

4 討論

重感靈片為七味中藥飲片經(jīng)提取濃縮加工并與兩種化學(xué)原料藥組成的中西藥合制片劑，對(duì)治療惡寒發(fā)熱、四肢酸痛、咽喉腫痛等癥狀效果明顯。本產(chǎn)品為臨床治療感冒類常用藥品，其安全性、有效性已有研究，質(zhì)量可控性有必要進(jìn)一步完善。重感靈片主要成分葛根在重感靈片中屬于臣藥且用量較大，用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中。重感靈片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS-10872（ZD-0872）-2002-2011Z），其含量測(cè)定項(xiàng)僅測(cè)定其中安乃近成分。但作為中西藥結(jié)合制劑，僅控制其中的西藥安乃近成分略顯單薄，不能夠全面反映重感靈片中屬于臣藥且用量較大葛根的重要價(jià)值，不能有效地、全面的控制重感靈片內(nèi)在質(zhì)量，尤其是對(duì)主要中藥單品的控制。近年來(lái)，中藥材在種植過(guò)程中受到產(chǎn)地、土壤、氣候、光照、溫度、水分及采收季節(jié)等因素的影響，從而影響到重要原料飲片有效成分在產(chǎn)品中實(shí)際含量。葛根在重感靈片中藥組分中屬于臣藥且用量較大，所以測(cè)定其有效成分葛根素含量有重要價(jià)值，為了更進(jìn)一步確保上市后藥品的有效性和安全性，本研究對(duì)重感靈片中葛根素含量檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行研究，以提升產(chǎn)品質(zhì)量控制。

本文結(jié)合現(xiàn)行中國(guó)藥典2020年版中藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，對(duì)重感靈片中的葛根素用HPLC法測(cè)定在符合驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求下進(jìn)行驗(yàn)證，能夠準(zhǔn)確檢出重感靈片中葛根素的含量。

此試驗(yàn)檢測(cè)表明，葛根素對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品圖譜峰形好，分離度、理論板數(shù)符合要求。葛根素在0.406μg～2.03μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r=0.9993），平均加樣回收率為96.58%，RSD為1.60%。樣品在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，樣品測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性良好，RSD為1.44%。結(jié)果均滿意。

本研究所建立的HPLC法測(cè)定重感靈片中葛根素含量的方法，準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、線性關(guān)系及耐用性良好，并利用該方法對(duì)不同批次重感靈片中葛根素含量進(jìn)行了測(cè)定，符合標(biāo)準(zhǔn)制定和復(fù)核的相關(guān)要求，因此，此方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，可以作為重感靈片中葛根素的含量測(cè)定方法，可用于此產(chǎn)品的質(zhì)量控制，建議列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地為產(chǎn)品質(zhì)量控制服務(wù)。