鞏高霞 陶迎泰 王娜 李躍躍 郝玉蘭 黃晨瑤 鄭立穎，2，3

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.植物生產(chǎn)類國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一種主要特征為鼻癢、噴嚏、流涕的慢性鼻黏膜炎癥［1］，分為季節(jié)性和常年性，其中季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎占20%，常年性變應(yīng)性鼻炎占40%，混合型占40%［2］。目前全球約有6億多人患有不同程度的過敏性鼻炎，且患病人數(shù)還在逐年遞增［3］。查閱文獻(xiàn)，中醫(yī)外治慢性鼻-鼻竇炎的方法包括熏蒸法、沖洗法、超聲霧化法、塞鼻法、滴鼻及噴鼻法等［4］。由于過敏性鼻炎難以根治的特殊性，開發(fā)防護(hù)用品在過敏性鼻炎預(yù)防和減輕癥狀方面具有一定優(yōu)勢。

針對名家經(jīng)驗(yàn)方（辛夷、白芷、薄荷、蒼耳子、鵝不食草）組成的防護(hù)配方，對其中主藥辛夷所含成分木蘭脂素進(jìn)行了含量測定，為防護(hù)配方的后期開發(fā)進(jìn)行質(zhì)量控制探索。

1 儀器及材料

1.1 儀器 LC-2030Plus高效液相色譜儀（島津）、紫外檢測器，HX-203T電子天平、SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)。

1.2 材料 木蘭脂素對照品（批號：YR-3111812017，含量HPLC>98%，陜西寶雞市翊瑞生物科技有限公司）、鼻炎防護(hù)配方藥粉。

1.3 試劑 甲醇、乙腈為色譜純，乙酸乙酯為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Extrad-C18色譜柱（4.6mm×250mm×5nm），流動相：乙腈-水（45∶55），檢測波長：203nm，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：5μL，柱溫：35℃。

2.2 供試品溶液制備 供試品制備選用三種方法，依次為甲醇提?。↗組）、甲醇提取水浴蒸干后用流動相（乙腈-水）溶解（JY組）、乙酸乙酯提取水浴蒸干后用流動相溶解（YY組），具體操作如下。

2.2.1 甲醇溶液樣品的制備。取五份配方藥粉精密稱定，分別精密加入甲醇30mL，依次稱定，超聲頻率40kHz，30℃超聲提取30min后取出，稱定，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾紙過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液即得。

2.2.2 乙酸乙酯溶液樣品的制備。同上取2份配方藥粉精密稱定，各精密加入乙酸乙酯50mL，超聲提取條件及其他操作同甲醇溶液樣品制備。

2.2.3 乙腈-水（1∶1）溶液樣品的制備。精密吸取甲醇樣品溶液3份、乙酸乙酯樣品溶液2份，每份10mL，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，冷卻，再精密加入乙腈-水（1∶1）混合溶液10mL溶解，濾紙過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液即得。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱定木蘭脂素對照品13mg，加甲醇溶解定容，配成1.3mg/mL的儲備液。取木蘭脂素儲備液，用流動相稀釋成8、15、80、100、155、650、800、1000μg/mL系列溶液。

2.4 陰性對照樣品制備 除辛夷外，其余藥材按照配方比例混合制備辛夷陰性配方，按照2.2.1用甲醇制備陰性對照樣品。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn)。取甲醇樣品液、木蘭脂素對照品溶液、陰性對照樣品液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。陰性對照樣品在與木蘭脂素相同保留時(shí)間未見吸收峰。具體見圖1。

圖1 陰性對照的甲醇提取樣品HPLC色譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線。取木蘭脂素對照品系列溶液依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，測得木蘭脂素標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=52542X-112343（相關(guān)系數(shù)R=0.9997R2=0.9995），結(jié)果表明，木蘭脂素在8～1000μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積線性關(guān)系良好。見圖2。

圖2 800μg/mL木蘭脂素對照品HPLC色譜圖

2.5.3 精密度考察。取濃度為800μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定6次，計(jì)算含量，平均值為794.428μg/mL，結(jié)果顯示RSD%為0.696%，說明方法精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取配方藥粉的甲醇提取制備的樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，10h內(nèi)每2h測定1次，記錄峰面積。結(jié)果顯示RSD%為1.48%，表明樣品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取配方藥粉的同一甲醇提取樣品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果顯示RSD%為1.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)。精密量取配方藥粉的同一甲醇提取樣品溶液6份，分別加入定量木蘭脂素對照品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示木蘭脂素的平均回收率為98.36%，RSD%為2.68%，表明該方法可靠。

2.6 含量測定 依次將配方藥粉的甲醇樣品溶液、乙腈-水樣品溶液經(jīng)微孔濾膜過濾，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入色譜儀。測定結(jié)果見圖3、表1。

圖3 甲醇提取樣品HPLC色譜圖

表1 不同溶劑方法制備的供試品中木蘭脂素含量

由上表可知不同溶劑提取制備的樣品溶液測得木蘭脂素濃度有差異，折合計(jì)算配方藥粉中木蘭脂素平均含量依次為甲醇組0.5139%、甲醇乙腈組0.5055%、乙酸乙酯乙腈組0.5916%。結(jié)果提示配方藥粉中木蘭脂素含量以乙酸乙酯先提取再轉(zhuǎn)換為流動相溶劑測得值最高，甲醇提取測得木蘭脂素含量稍高于甲醇提取再轉(zhuǎn)換溶劑，但兩者相差不足萬分之一。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為過敏性鼻炎屬“鼻鼽”范圍，其主要病因與外感之邪和臟腑虛損密切相關(guān)，尤其是肺脾氣虛［5］。張莉莉等在總結(jié)仝小林教授治療鼻炎小方中提及鼻炎發(fā)病因素包括局部的細(xì)菌感染、黏膜變態(tài)反應(yīng)以及全身的系統(tǒng)性慢性疾病如貧血、糖尿病、長期過度疲勞等［6］。羅永紅等報(bào)道中藥外用治療過敏性鼻炎所用的中藥主要是辛溫藥為主［7］，劉金壘等檢索2009～2019年的220項(xiàng)過敏性鼻炎用藥專利，總結(jié)其中使用頻率較高的中藥有防風(fēng)、辛夷、白芷、蒼耳子，高頻藥對有“防風(fēng)-辛夷”、“黃芪-防風(fēng)”、“白芷-辛夷”、“蒼耳子-辛夷”及白芷-蒼耳子［8］。宋鑫彤等報(bào)道在經(jīng)驗(yàn)方復(fù)方辛蒼散（由蒼耳子、辛夷、薄荷組成）原方的基礎(chǔ)上加入鵝不食草，其在改善鼻炎豚鼠模型的各種變應(yīng)性鼻炎癥狀和體征方面效果明顯，各組動物的噴嚏次數(shù)、流涕程度、擦鼻次數(shù)、抓鼻周次數(shù)降低，尤其是噴嚏次數(shù)改變明顯［9］。劉珊珊、曾友志等在治療變應(yīng)性鼻炎的多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，含有鵝不食草的辛夷鼻炎丸和通竅鼻炎顆粒治療中無不良反應(yīng)發(fā)生［10-11］。上述文獻(xiàn)提示根據(jù)經(jīng)驗(yàn)方制作的過敏性鼻炎防護(hù)配方有臨床應(yīng)用研究基礎(chǔ)。

本次以乙腈-水（45∶55）為流動相測定木蘭脂素含量，與田蜜等［12］報(bào)道的測定方法相近，但木蘭脂素的保留時(shí)間約8min，比文獻(xiàn)報(bào)道保留時(shí)間縮短近3min，主要原因是C18色譜柱品牌不同。對于防護(hù)配方藥粉樣品的HPLC色譜圖中木蘭脂素峰，后期還將通過微調(diào)流動相配比、流速，實(shí)現(xiàn)更好的分離效果。防護(hù)配方藥粉的甲醇和乙酸乙酯提取制備樣品溶液HPLC測定結(jié)果相差約0.08%，甲醇提取制備樣品溶液與轉(zhuǎn)溶流動相制備樣品的木蘭脂素含量測定結(jié)果基本接近，表明制備樣品溶液的提取溶劑對測定結(jié)果影響大于用高效液相流動相進(jìn)行樣品溶劑置換，甲醇提取測得防護(hù)配方藥粉中木蘭脂素含量平均值為0.514%，轉(zhuǎn)換溶劑后測得平均值為0.506%，說明樣品甲醇溶液可不轉(zhuǎn)換溶劑直接進(jìn)樣，對測定結(jié)果的影響可忽略。由于乙酸乙酯極性與流動相相差較大，應(yīng)轉(zhuǎn)換溶劑后進(jìn)樣。在轉(zhuǎn)換溶劑過程中觀察到，雖然相同固液比制成的甲醇和乙酸乙酯提取液均有深綠色不溶物殘?jiān)?，且乙酸乙酯殘?jiān)棵黠@多于甲醇，但乙酸乙酯提取物的測定結(jié)果大于甲醇，說明對于辛夷及其制劑在測定木蘭脂素時(shí)宜選用乙酸乙酯進(jìn)行前期提取，這與《中國藥典》辛夷項(xiàng)下供試品制備溶劑規(guī)定一致。

此外，防護(hù)配方中各味藥材均含揮發(fā)性成分，文獻(xiàn)報(bào)道，辛夷揮發(fā)油能夠較好地抑制IL-12、TNF、PLA2以及PGE2、組胺等炎癥介質(zhì)的生成，起到治療過敏性鼻炎的作用［13-14］。因此，后期還需對防護(hù)配方所含揮發(fā)性成分進(jìn)行考察，進(jìn)一步完善質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。