崔松奇，張文芳，張丹丹，余海濤，劉 洋，孔 敏，田春利

(豪威生物科技有限公司，天津 武清 301700)

0 引言

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，臨床癥狀表現(xiàn)為恐水、恐光、狂躁不安等[1]。狂犬病病毒可感染犬、貓、狐貍等溫血動物，人一旦感染，致死率幾乎100%[2]。據(jù)估計，狂犬病流行于全球150多個國家，每年造成約59 000人死亡，其中95%的病例發(fā)生在非洲和亞洲[3]，其中亞洲占56%，非洲占44%。大多數(shù)死亡(84%)都發(fā)生在農(nóng)村地區(qū)，其主要原因是對于犬狂犬病監(jiān)管力度不足[4]。我國狂犬病全年都有流行，但相對集中于夏秋季節(jié)，主要是農(nóng)民、學(xué)生、散居兒童發(fā)病較多。世界衛(wèi)生組織( World Health Organization，WHO) 建議將犬類狂犬病疫苗接種率提高至 70%，以有效阻止狂犬病毒的傳播[5]。大規(guī)模犬類免疫接種也是消除人類狂犬病的根本措施[6]。因此探索狂犬病病毒獸用疫苗制備工藝，研制安全高效價的獸用疫苗，從源頭控制，以切斷動物散毒途徑，對控制人感染狂犬病病毒事件的發(fā)生具有重大意義。

1 材料

實驗動物:昆明系小鼠，11～13 g，購自北京實驗動物中心。

檢驗用強毒狂犬病固定毒巴黎株:代號AV2011，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。

狂犬病參考疫苗標準品: 由豪威生物科技公司制備。

狂犬病疫苗效力檢測試劑盒:購自武漢生物制品研究所。

β-丙內(nèi)酯(BPL):Alfa-Aesar公司產(chǎn)品，純度97%，批號:33672。

層析柱(Index Column 140/950)及配件:購自GE 公司。

柱材(Sepharose 4Fast Flow ):購自GE 公司。

UV檢測器:購自GE公司。

經(jīng)超濾濃縮50倍的抗原:由本公司生產(chǎn)車間提供。

0.2 m2冷凍真空干燥機:型號GZLY-0.2，購自奧特佳美科技有限公司。

15 m2冷凍真空干燥機:購自上海遠東制造總廠。

2 方法

2.1 純化試驗

1)上樣量優(yōu)化試驗:將滅活檢驗合格的50倍濃縮抗原分別以600 mL、960 mL和1 200 mL上樣，固定洗脫流速102 mL/min不變，經(jīng)Sepharose 4 Fast Flow (4FF)柱層析系統(tǒng)純化，用紫外蛋白檢測儀在280 nm波長下檢測分離液，分步收集各洗脫峰。

2)洗脫流速優(yōu)化試驗:以試驗中確定的最佳上樣量進行上樣，改變洗脫流速，分別以77 mL/min、102 mL/min和128 mL/min進行洗脫，用紫外蛋白檢測儀在280 nm波長下檢測分離液，分步收集各洗脫峰。

3)使用狂犬病病毒糖蛋白檢測試劑盒對不同上樣量和不同洗脫流速下的各洗脫峰進行檢測。

2.2 凍干曲線優(yōu)化試驗

1)為達到理想的冷凍干燥效果，將無菌的狂犬病純化抗原與耐熱保護劑混合，測定混合液的共晶點與塌陷溫度。本研究采用電阻法確定制品的共晶點，采用低溫凍干顯微鏡測定塌陷溫度，以控制冷凍干燥中預(yù)凍溫度及升華過程主干燥溫度。

2)疫苗凍干程序的設(shè)計。根據(jù)測定的共晶點溫度和塌陷溫度設(shè)計4條凍干程序如表1所示。

3)使用NIH(National Institutes of Health)法對凍干前后產(chǎn)品開展效力檢測。

4)對凍干后產(chǎn)品進行物理性狀檢測、剩余水分檢測、熱穩(wěn)定性試驗。

表1 凍干程序

3 試驗結(jié)果

3.1 純化試驗結(jié)果

1)不同上樣量純化效果比較，如表2所示。由表2可以看出，3個不同上樣量純化抗原的回收體積差別不顯著。當上樣量為600 mL時，A峰(ELISA檢測為狂犬病毒峰)基本可降至基線，B峰ELISA檢測狂犬病毒陰性，雜蛋白去除率在95%以上；上樣量增加至960 mL時，A、B峰間的連線縮短，但基本可分開，雜蛋白去除率較5%柱床體積上樣量降低了2%；而當上樣量增至1 200 mL時，A峰中蛋白含量增高，B峰的前幾管收集液經(jīng)ELISA檢測為病毒抗原陽性，雜蛋白去除率較5%和8%柱床體積上樣量大幅度降低，只有79%左右。

2)不同洗脫流速純化效果比較如表3所示。由表3可以看出，隨著洗脫流速的增加，A、B峰間的連線越來越短，以128 mL/min洗脫時，無論是雜蛋白去除率還是抗原回收率效果均不如77 mL/min和102 mL/min。

表3 不同洗脫流速下純化效果比較

綜上所述，兼顧純化效率及分離效果，確定Index Column 140/950層析柱層析分離濃縮狂犬病毒抗原的最佳上樣量為960 mL(8%柱床體積)、最佳洗脫流速102 mL/min(線性流速40 cm/hr)。

3.2 凍干曲線優(yōu)化試驗

1)共晶點與塌陷溫度的測定。對狂犬病純化抗原與耐熱保護劑混合液進行共晶點與塌陷溫度的測定，共晶點溫度為28.6 ℃，塌陷溫度為24.9℃～22.3℃。

2)凍干前后效力檢測結(jié)果，如表4所示。由表4各凍干程序凍干制品凍干前后效力檢測結(jié)果可以看出，凍干程序3和凍干程序4的凍干效力損失基本相當，優(yōu)于凍干程序2，由于凍干程序1在凍干過程中融化發(fā)泡，未進行效力檢測。

表4 各凍干程序凍干制品凍干前后效力檢測結(jié)果 單位：IU

3)凍干產(chǎn)品物理性狀檢測、真空度檢測、剩余水分檢測結(jié)果，如表5所示。由表5凍干制品物理性狀、真空度、剩余水分檢測結(jié)果可以看出，凍干程序3、凍干程序4的物理性狀、要優(yōu)于凍干程序1和凍干程序2，在剩余水分方面，凍干程序4的剩余水分偏高，整體來看，凍干程序3在所有凍干程序中是最優(yōu)的。

表5 各凍干程序凍干制品物理性狀、真空度、剩余水分檢測結(jié)果

4)各凍干程序凍干制品熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果，如表6所示。由表6熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果可以看出，程序3凍干后制品熱穩(wěn)定性試驗效力損失最小，且37℃ 10 d后制品的物理性狀依然合格。程序4凍干后的制品熱穩(wěn)定性試驗效力損失最大，且37℃ 10 d后制品的物理性發(fā)生嚴重萎縮現(xiàn)象，從本次熱穩(wěn)定性試驗的結(jié)果可以推測，凍干制品的剩余水分對制品的保存影響很大。

表6 各凍干程序凍干制品熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果 單位：IU

4 討論

本文研究的是不同上樣量和洗脫流速對凝膠過濾純化效果的影響。上樣量過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，生產(chǎn)效率低[7]。洗脫速度也會影響凝膠過濾的分離效果，洗脫速度要恒定而且合適。一般來講，洗脫速度慢一些，樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好，但洗脫速度過慢又會造成樣品擴散，加劇區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，而且生產(chǎn)時間會大大延長，所以實驗中應(yīng)根據(jù)實際情況來選擇合適的洗脫速度[8]。通過試驗顯示，當上樣量為5%～8%柱床體積時，病毒峰與雜蛋白峰可以完全分開，雜蛋白去除率在93%以上。洗脫流速是柱層析獲得良好分離效果的另一重要條件，隨著洗脫流速的增加，A、B峰間的連線越來越短，以128 mL/min洗脫時，無論是雜蛋白去除率還是抗原回收率效果均不如77 mL/min和102 mL/min，這是因為凝膠層析的分離作用主要取決于分子擴散進入凝膠的機會，流速過快有些分子來不及在分子篩中分配而流出。

真空冷凍干燥主要分為預(yù)凍、一次干燥和二次干燥。在凍干過程中要根據(jù)保護劑特性調(diào)整凍干程序，因此凍干工藝參數(shù)是調(diào)節(jié)凍干程序的重要依據(jù)之一，包括制品的固化溫度和崩解溫度[9]。預(yù)凍階段，保證制品的溫度低于共晶點溫度，使得制品完全凍實，本次所有凍干曲線的預(yù)凍溫度均設(shè)定為-42℃，保證了制品完全凍結(jié)；一次升華階段，制品的溫度要低于塌陷溫度，防止制品出現(xiàn)局部或者整體塌陷的情況，當一次升華溫度設(shè)定為-13℃和-18℃時，制品溫度始終低于塌陷溫度，制品外觀光滑、疏松，但由于-18℃的設(shè)定溫度偏低，凍干導(dǎo)致制品的殘余水分增加，干燥效率降低，同時由于殘余水分過大，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性試驗中制品出現(xiàn)了萎縮的現(xiàn)象，使得制品的效力大幅度下降。

5 結(jié)論

狂犬病滅活疫苗下游工藝，純化時樣品的上樣量為8%柱床體積，洗脫流速為30～40 cm/hr的線性流速，最后純化抗原加入凍干保護劑冷凍干燥，該生產(chǎn)工藝通過驗證可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)，實現(xiàn)了狂犬病凍干滅活疫苗下游工藝規(guī)?；a(chǎn)。