李棟梁 史永林 金 晶 曾 臻 何麗芳 盧 林

諾如病毒(Norovirus，NoV)是導(dǎo)致人類急性胃腸炎主要病原體之一，主要引起食源或水源性急性胃腸炎，WHO定其為B類病原[1-2]。在世界范圍內(nèi)，73%～95%的感染性腹瀉疫情暴發(fā)與NoV有關(guān)[3]。每年全球NoV所致疾病負擔(dān)高達60億美元[4]。一般情況下，NoV感染為自限性疾病，但免疫功能較低的人群可以引起嚴重脫水等癥狀，世界上每年約21.2萬人因NoV感染死亡[5]。NoV感染的疫情主要發(fā)生在冬春季，人口聚集場所或者半封閉環(huán)境高發(fā)，如幼兒園、中小學(xué)校、游船、高校、人員密集的工廠[6]。對于NoV感染疫情防控，開展病原鑒定、調(diào)查傳播途徑和源頭有著至關(guān)重要的作用，2020年11月，合肥市X小區(qū)的NoV感染性腹瀉疫情，鑒定病原為NoV，通過分析NoV感染者和在社區(qū)環(huán)境陽性分布特點，研究其傳播方式和防控措施，同時利用生物信息學(xué)技術(shù)調(diào)查其傳播源頭，為以后處置社區(qū)諾如疫情提供借鑒，為政府制定社區(qū)傳染病防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 對本次疫情13例病例開展調(diào)查研究，病例包括臨床確診病例和實驗室確診病例，病例定義規(guī)定如下，臨床確診病例：2020年11月11～15日，X小區(qū)居民出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹瀉(≥3次/24小時，且有性狀改變)癥狀任意2項者；實驗室確診病例：臨床病例中，糞便、肛拭子或嘔吐物標本經(jīng)諾如病毒核酸檢測陽性者。

1.2 方法 按照病例定義在小區(qū)內(nèi)開展病例搜索，病例搜索方式包括小區(qū)居民主動報告和調(diào)查人員走訪搜索，對病例流行病學(xué)調(diào)查，填寫《NoV感染性腹瀉個案調(diào)查表》，個案調(diào)查表內(nèi)容包括基本信息、就餐情況、發(fā)病情況、診療過程、外出行程和可疑暴露史等，調(diào)查完成后進行流行病學(xué)描述性分析。

1.2.1 病例對照研究 所有病例作為病例組，同時隨機抽樣調(diào)查健康兒童作為對照組，病例和對照樣本按照1∶2配比，開展病例對照研究，驗證疫情傳播危險因素假設(shè)。

1.2.2 衛(wèi)生學(xué)調(diào)查 對飲用水衛(wèi)生學(xué)調(diào)查，現(xiàn)場采集末梢水樣，進行小區(qū)二次供水的余氯測定、病原學(xué)檢驗。調(diào)查該小區(qū)整體環(huán)境衛(wèi)生狀況、樓棟內(nèi)通風(fēng)狀況、垃圾清理清理、公共場所消毒頻次等。調(diào)查病例之間有無共同就餐史。

1.2.3 標本采集 采集患者肛拭子，用棉簽輕輕插入患者肛門內(nèi)3 cm，緩慢轉(zhuǎn)動3～5圈后取出，將棉簽置于盛有3 mL Hank’s 液的采樣管；水樣本要求采集 1 L以上的水樣品，自來水用無菌容器采集；環(huán)境樣本用無菌拭子在無菌 Hank’s 液里蘸濕，用力電梯按鈕、滑滑梯扶手、門把手等待采表面(最大面積 100 cm2)后，將拭子放入3 mL Hank’s 液的采樣管內(nèi)待檢；所有樣本冷藏條件下保存送至實驗室檢測。

1.2.4 實驗室檢測 采用膜過濾法(濾膜孔徑為0.22 μm)對所采水樣濃縮后待檢。采用中國臺灣圓點奈米技術(shù)股份有限公司病毒核酸提取試劑盒，抽提所有樣本RNA或DNA，按廣州達安基因股份有限公司生產(chǎn)的熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒說明書要求，對患者肛拭子、環(huán)境涂抹樣和水的核酸抽提物分別進行輪狀病毒、星狀病毒、腸道腺病毒、NoV及札如病毒核酸檢測。依據(jù)GB4789-2016對肛拭子和水進行致瀉性大腸桿菌、空腸彎曲菌、沙門菌和弧菌的分離培養(yǎng)。依據(jù)GB/T5750-2006對水進行余氯檢測。

1.2.5 實驗室結(jié)果判定標準 核酸結(jié)果陽性:每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達到設(shè)閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)<40，有明顯指數(shù)增長；陰性：Ct值>40或無Ct值；可疑：Ct值為40～43，重復(fù)檢測，若仍在此范圍，有明顯指數(shù)增長，則判為陽性，否則陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用Excel 2013建立數(shù)據(jù)庫，利用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對已錄入的資料進行分析，病例三間分布采用描述流行病學(xué)，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，計算OR值，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 生物信息學(xué)分析方法 利用sanger技術(shù)測序，獲得陽性樣本基因序列，利用CLUSTAL進行序列比對，分別利用NCBI blast在線同源搜索該基因型的同源序列和NoV https://www.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/在線檢索工具檢索基因型。

2 結(jié)果

2.1 疫情概況 X小區(qū)位于合肥市高新區(qū)居民密集區(qū)，共有26棟樓，均為電梯高層，2 846戶，9 102人。小區(qū)有2個兒童游樂區(qū)、2個中心廣場。2020年11月15日11時， X小區(qū)報告腹瀉疫情?，F(xiàn)場共搜索到病例13例，其中托幼兒童2例、散居兒童11例，罹患率為0.14%，其中就診病例5例，未就診病例8例；無重癥和死亡病例。

2.2 描述流行病學(xué)分析

2.2.1 首發(fā)病例發(fā)病情況 朱某，男性，1歲，11月11日在家出現(xiàn)嘔吐癥狀，伴有腹瀉，無發(fā)熱癥狀。該病例發(fā)病無類似病例接觸史，無外出史，僅在小區(qū)內(nèi)部兒童游樂場、中心廣場活動。發(fā)病后立即在家休息，未就診。

2.2.2 時間分布 11月11日2例；12日1例；13日達到高峰，6例；14日2例；15日2例；最后1例病例出現(xiàn)在11月15日。該社區(qū)居民平均罹患率為0.14%(13/9 102)。見圖1。

圖1 確診病例時間分布圖

2.2.3 空間分布 病例分布在9棟樓，分別為9、10號樓各3例；11號樓2例；4、8、13、14、26號樓各1例。病例集中在9、10號樓，共發(fā)病6例，占總病例數(shù)的46.2%。見圖2。

2.2.4 人群分布 男性5例，女性8例。發(fā)病人群年齡最大5歲，最小11個月齡，中位年齡為1歲。

2.3 衛(wèi)生學(xué)調(diào)查結(jié)果 該小區(qū)環(huán)境消毒不規(guī)范，消毒人員消毒知識不足，消毒液配比不合格，消毒頻次不夠，樓棟內(nèi)通風(fēng)不良。在兒童游樂場的滑梯附近有嘔吐物，嘔吐物未及時清理消毒處置。所有病例之間近期均無共同就餐暴露史。

2.4 樣本實驗室檢測結(jié)果 病毒核酸檢測結(jié)果，所有標本的輪狀病毒、星狀病毒、札如病毒核酸均為陰性。10份肛拭子中，9份NoV核酸陽性GII型，42份環(huán)境涂抹樣中，13份NoV核酸陽性GII型；所有樣本未檢出致瀉性大腸桿菌、空腸彎曲菌、沙門菌和弧菌；3份水標本NoV核酸陰性，余氯正常。見表1。

2.5 傳播危險因素病例對照結(jié)果 開展病例對照研究，把去過小區(qū)游樂場作為危險因素，13例病例作為病例組，去過游樂場10例；按照同小區(qū)、同樓棟、同單元、1∶2配比的原則，選擇26例健康兒童作為對照組，去過游樂場11例，OR=4.545,95%CI:1.008～20.507。OR值結(jié)果顯示，去過小區(qū)游樂場的發(fā)病危險性是未去過游樂場的4.545倍，可能是接觸到游樂場受到污染的設(shè)施，導(dǎo)致NoV感染高發(fā)于未去過游樂場玩的兒童，受到污染的游樂場器材和環(huán)境是傳播危險因素。見表2。

表1 本次疫情采樣檢測結(jié)果一覽表

表2 本次疫情傳播危險因素病例對照結(jié)果

2.6 生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖3 社區(qū)內(nèi)陽性樣本序列比對

圖4 社區(qū)陽性樣本與同源序列比對

本研究利用sanger測序技術(shù)共獲得了5株NoV RdRp-VP1區(qū)基因序列，分別為Hefei-N20756、Hefei-N20757、Hefei-N20760、Hefei-N20763、Hefei-N20768，前4個序列片段來自患兒肛拭子標本，后1個片段來自某電梯前地面涂抹樣。基因序列比對結(jié)果顯示這5份樣品序列高度一致，表明該社區(qū)發(fā)生的疫情是由同一種病毒引起的。見圖3。進一步利用通過NCBI在線 blast，結(jié)果顯示，該病毒序列與北京兒科研究所感染與病毒學(xué)研究室提交的序列MW205562.1、MW205654.1、MW205623.1和MW205587.1高度同源，屬于NoV GⅡ型，均編碼RdRp和VP1。再利用NoV https://www.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/ 在線檢索工具，顯示該病毒屬于GⅡ. 4 [P31]類型。見圖4。

3 討論

NoV屬于人類杯狀病毒科，是引起非細菌性急性胃腸炎疫情的重要病原體[7]。人類對NoV研究較為深入，尤其是近期體外培養(yǎng)成功以來，對于NoV的分子生物學(xué)研究突飛猛進[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，NoV的環(huán)境適應(yīng)能力非常強，在外界0℃～60℃可生存活數(shù)月甚至更長，人類對NoV普遍易感且感染劑量較低，臨床試驗中半數(shù)志愿者感染的劑量為18個病毒顆粒。NoV感染個體后，潛伏期內(nèi)可排毒，排毒時間可長達5 d，導(dǎo)致疫情不易被發(fā)現(xiàn)和控制[10]。另外，NoV不單具有腸道細胞嗜性，對免疫細胞也具有嗜性，這使得人體感染后產(chǎn)生免疫抑制[11]。上述原因?qū)е翹oV具有高傳染性、高致病力和快速傳播能力，極易引起聚集性發(fā)病，產(chǎn)生嚴重疾病負擔(dān)[12]。近年來,我國非常重視NoV感染的防控，2015年制定了《NoV感染暴發(fā)調(diào)查和預(yù)防控制技術(shù)指南(2015版)》[13]，為處理諾如疫情提供了依據(jù)。

本起疫情由于正值新型冠狀病毒疫情防控期間，得益于疫情防控指揮部建立的衛(wèi)生、教育、社區(qū)等多部門聯(lián)動機制，疫情報告較早，處置及時，沒有引起大范圍暴發(fā)，沒有波及附近小學(xué)和幼兒園。

所有病例之間近期均無共同就餐暴露史，可以排除食源性安全事件的可能。衛(wèi)生學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飲水衛(wèi)生較好，余氯正常，病原學(xué)檢驗陰性可以排除水源性傳播的可能。

流行病學(xué)調(diào)查資料顯示病例數(shù)逐日增加，到達高峰后，逐日減少，符合傳染病發(fā)生規(guī)律，病例的臨床表現(xiàn)為嘔吐腹瀉，結(jié)合實驗室檢驗結(jié)果為NoV陽性，判斷該疫情為一起由社區(qū)外輸入、通過環(huán)境傳播的NoV感染聚集性疫情。

衛(wèi)生學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)該小區(qū)外環(huán)境消毒不規(guī)范，消毒人員消毒知識不足，消毒液配比不合格，消毒頻次不夠，導(dǎo)致外環(huán)境污染，采樣陽性。傳播途徑危險因素病例對照研究結(jié)果顯示，兒童游樂場受到污染的器材和環(huán)境可能是發(fā)病的危險因素。這些都直接和間接說明，該起疫情是一起通過社區(qū)外環(huán)境傳播的NoV感染聚集性疫情。通過本次疫情處置，為社區(qū)的公共衛(wèi)生管理敲響了警鐘。在以后的工作中，要加強社區(qū)管理人員疫情防控知識的培訓(xùn)，特別是消毒知識的培訓(xùn)。

本文在闡述NoV疫情處置的同時，還對NoV基因型進行分析，本研究獲得的毒株為NoV GⅡ.4 [P31]型，與北京地區(qū)2018～2020年發(fā)生的NoV疫情高度同源[14]。NoV GⅡ一直是NoV的6 個基因組群里的優(yōu)勢流行株，特別是GⅡ.4[15]，該毒株的暴發(fā)感染疫情占所有NoV感染的62%[16]。NoV感染與宿主的組織血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)直接相關(guān)，而GⅡ.4 可以結(jié)合到幾乎所有的HBGAs，因此,GⅡ.4病毒發(fā)病率較其他基因組群的毒株高。本文基因分型對于處理諾如疫情提供了分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)。

疾控部門采取了隔離傳染源、切斷傳播途徑、保護易感人群等防控措施，加大病例搜索力度，發(fā)現(xiàn)新發(fā)病例第一時間上報，實行每日零報告制度，封閉管理，小區(qū)內(nèi)避免聚集，積極開展健康教育工作，有效控制疫情。