林利忠 關(guān)助明 林澤金

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床上較為常見的一種慢性骨關(guān)節(jié)疾病[1-2]，早期診斷及積極治療可有效延緩疾病進(jìn)展并及早對(duì)預(yù)后做出判斷。微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)是由20～24核苷酸組成的小分子非編碼RNA，可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)而參與多種生理病理過程[3]。穆尚強(qiáng)等[4]研究證實(shí)，在KOA患者的關(guān)節(jié)液中有多種miRNAs的表達(dá)均有異常。關(guān)節(jié)軟骨主要從流動(dòng)的關(guān)節(jié)液及軟骨下骨中獲取營養(yǎng)和氧，關(guān)節(jié)軟骨中低氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)能夠調(diào)控軟骨細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性[5]。相關(guān)研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在KOA患者的關(guān)節(jié)液中miR-138呈顯著下調(diào)，關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α信使RNA(Messenger RNA，mRNA)呈顯著上調(diào)，二者均有可能是KOA前期

的檢查和診斷的監(jiān)測標(biāo)志物。為了進(jìn)一步研究KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α的作用，本研究利用檢測二者的表達(dá)，并探討其變化與意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2019年1月深圳龍華區(qū)中心醫(yī)院收治的46例KOA患者作為研究組，參照凱爾格倫-勞倫斯(Kellgren-Lawrence，K-L)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)KOA患者(研究組)進(jìn)行分級(jí)：Ⅱ級(jí)11例、Ⅲ級(jí)22例、Ⅳ級(jí)13例。同時(shí)選取46例同期非KOA患者(因發(fā)生車禍或嚴(yán)重?fù)p傷等需要進(jìn)行下肢截肢手術(shù)且均為非KOA患者)作為對(duì)照組。兩組患者一般資料進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]者。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷者；膝關(guān)節(jié)有手術(shù)史者；近期接受非甾體類抗炎藥或糖皮質(zhì)激素類治療者；有自身免疫性疾病或炎癥性關(guān)節(jié)炎者。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重心、肝、腎疾病者；關(guān)節(jié)軟骨破損嚴(yán)重者；有血液病者；有惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：201802-001)，所有患者均知情同意。

1.3 樣本的收集及儲(chǔ)存

1.3.1 關(guān)節(jié)液標(biāo)本 無菌收集兩組患者的關(guān)節(jié)液各約3 mL，室溫條件下靜置1 h后，于離心機(jī)內(nèi)以3 500 r/s轉(zhuǎn)速離心處理10 min。去除細(xì)胞和關(guān)節(jié)組織殘存碎片，分離上清液于新的EP管，-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.3.2 關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本 兩組患者均在術(shù)中切除關(guān)節(jié)軟骨，所有標(biāo)本均在離開體后30 min內(nèi)取材完成并于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測方法

1.4.1 關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測。分別取兩組患者關(guān)節(jié)液各3 mL并提取其中的總RNA，使用微量分光光度計(jì)檢測濃度和純度。然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的脫氧核糖核酸(complementary Deoxyribonucleic Acid，cDNA)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃ 30 min→42℃ 30 min→85℃ 5 min。U6的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 30 min→85℃ 5 min。取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行qRT-PCR。以U6作為內(nèi)參，正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-138正向引物為5’-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3’，反向引物為：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；反應(yīng)條件：95℃ 10 s；95℃ 15 s→60℃ 20 s 40個(gè)循環(huán)；60℃ 3 min。2-ΔΔCt法計(jì)算關(guān)節(jié)液中miR-138的相對(duì)表達(dá)量。

采用qRT-PCR法檢測關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)情況：分別取兩組患者軟骨組織標(biāo)本各80 mg，提取軟骨組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定每個(gè)樣本總RNA的A260/A280的比值，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。HIF-2α上游序列：5’-GAGGGTTTCATTGCTGTGGT-3’，下游序列：5’-CTCACGGATCTCCTCATGGT-3’；內(nèi)參為β-actin，上游序列：5’-TCGATATAGCTATAGCTAGC-3’；下游序列：5’-TCGATAGAGAGCAAGCTAGC-3’。反應(yīng)條件：94℃ 10 s；94℃ 10 s→60℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃ 3 min。2-ΔΔCt法計(jì)算關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α的相對(duì)表達(dá)量。

研究組患者膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后隨訪1年，復(fù)發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：①近1個(gè)月大多時(shí)間感到膝痛；②有骨贅形成；③膝關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)有骨膜擦音；④晨僵<0.5 h。將隨訪期間符合上述標(biāo)準(zhǔn)者記為復(fù)發(fā)，不符合則記為未復(fù)發(fā)。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察比較兩組患者關(guān)節(jié)液中miR-138及關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)比較；比較研究組不同分級(jí)患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)；比較研究組未復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者關(guān)節(jié)液中miR-138及關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)比較 研究組關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)低于對(duì)照組，研究組關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者關(guān)節(jié)液中miR-138與關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)比較

2.2 研究組不同分級(jí)患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)比較 不同分級(jí)患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Ⅱ級(jí)相比，研究組患者Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)均顯著降低，Ⅳ級(jí)又顯著低于Ⅲ級(jí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相較于Ⅱ級(jí)，研究組患者Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)均顯著升高，Ⅳ級(jí)又顯著高于Ⅲ級(jí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 研究組不同分級(jí)患者關(guān)節(jié)液中miR-138與關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)比較

2.3 研究組未復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)情況比較 研究組患者術(shù)后1年，共有7例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)患者關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)低于未復(fù)發(fā)患者，復(fù)發(fā)患者關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)高于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 未復(fù)發(fā)與復(fù)發(fā)患者關(guān)節(jié)液中miR-138和關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)情況比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示，研究組患者關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)顯著下調(diào)，且患者分級(jí)越高關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)越低，提示KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)減少，且與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。關(guān)節(jié)液主要由關(guān)節(jié)滑囊及腱鞘的滑液膜分泌，若膝關(guān)節(jié)發(fā)生病變，分泌的關(guān)節(jié)液中會(huì)出現(xiàn)病變代謝產(chǎn)物，并潴留在關(guān)節(jié)腔內(nèi)。miRNA主要是通過與RNA上對(duì)應(yīng)的應(yīng)答元件相結(jié)合發(fā)揮功能。有研究[11-12]顯示，miRNA廣泛參與機(jī)體的生理病理過程，當(dāng)miRNA與靶基因結(jié)合時(shí)，可起到抑制或促進(jìn)基因表達(dá)的作用。另有報(bào)道[13]指出，miR-138可作用于G蛋白偶聯(lián)受體激酶6，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及Bcl-2同源水溶性相關(guān)蛋白Bax，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，根據(jù)上述報(bào)道可推測KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)下降，對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)節(jié)功能減弱，使得軟骨細(xì)胞增殖減少而凋亡增多，因此可加重軟骨病理改變。此外，miR-108表達(dá)下降可影響局部代謝，使得有害代謝物質(zhì)如促炎癥因子等潴留，也是誘發(fā)并加重關(guān)節(jié)軟骨病變的主要原因[14]。本研究與上報(bào)道和分析相符，提示miR-108可能是KOA治療研究的潛在靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，研究組關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α的表達(dá)高于對(duì)照組，且研究組分級(jí)越高其表達(dá)越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示KOA患者HIF-2α表達(dá)顯著上調(diào)，且可能參與病情進(jìn)展。HIF-2α對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中的低氧誘導(dǎo)極為重要，主要在高分化的軟骨細(xì)胞中表達(dá)，是胚胎骨骼發(fā)育和培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的軟骨內(nèi)成骨所必須的細(xì)胞因子[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，HIF-2α可能與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的破壞及凋亡有關(guān)，是關(guān)節(jié)軟骨的主要調(diào)控因子，可以通過調(diào)控基質(zhì)分解酶類和多種炎癥因子等的表達(dá)誘發(fā)軟骨破損。另一方面，HIF-2α高表達(dá)可致使關(guān)節(jié)軟骨更易受到損害，進(jìn)而加重KOA患者的病情。此外，本研究中,研究組復(fù)發(fā)患者關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)低于未復(fù)發(fā)患者，而關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)高于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測二者異常表達(dá)可能與KOA復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。有報(bào)道[17]指出，miR-138表達(dá)下降可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞免疫紊亂，而細(xì)胞免疫紊亂則是影響患者預(yù)后的重要因素，但既往尚未見關(guān)于關(guān)節(jié)液中miR-138及關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α異常表達(dá)與KOA患者復(fù)發(fā)的關(guān)系報(bào)道，但是結(jié)合上述分析可以推測關(guān)節(jié)液中miR-138表達(dá)下降可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞大量凋亡，關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α高表達(dá)則可參與關(guān)節(jié)軟骨損害，因而二者均可增加KOA復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，關(guān)節(jié)液中miR-138及關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α表達(dá)與KOA的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估均有關(guān)。推測關(guān)節(jié)液中miR-138、關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α可能是KOA篩查、診斷的分子監(jiān)測物質(zhì)。由于KOA與多種因素調(diào)節(jié)相關(guān)，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，miR-138、HIF-2α是否能單獨(dú)適用于KOA篩查、診斷及評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測標(biāo)志物還需深入進(jìn)行研究。