王小柯, 羅 懌, 林 乾, 鄭乾明, 解 璞, 李文云

（貴州省果樹科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550006）

惠水金錢橘（朱紅橘）是柑橘屬寬皮柑橘中的朱橘類，果實(shí)較小，果皮油胞明顯，結(jié)果率較高，易剝皮，主要分布于貴州省惠水縣，已有300 多年的栽培歷史，是地方傳統(tǒng)柑橘品種［1］?；菟疱X橘歷來沿用實(shí)生繁殖，1992年選育者從當(dāng)?shù)剞r(nóng)民實(shí)生繁殖培育的金錢橘植株中遴選出1株優(yōu)良變異單株，經(jīng)多年試驗(yàn)示范，表現(xiàn)較好，2011年通過貴州省農(nóng)作物品種審定委員會審定，正式命名為“牛肉紅朱橘”［2］。該品種果皮紅如牛肉色，果肉呈暗紅色，剝皮時橘香濃郁，留香時間長，果肉脆嫩，風(fēng)味獨(dú)特，酸甜適口［3］，種子數(shù)較少或無種子。對牛肉紅朱橘及其親本的花器官結(jié)構(gòu)及花粉育性開展研究，分析牛肉紅朱橘種子少核或無核現(xiàn)象的原因，同時從花粉形態(tài)方面比較二者的差異，為其在孢粉學(xué)上的鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為15年生牛肉紅朱橘和惠水金錢橘植株，砧木為枳殼，種植于貴州省黔南州惠水縣爛壩林場，該地區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，果園海拔949.7 m，果園年均溫15.8℃。

1.2 方法

1.2.1 花粉粒形態(tài)觀察 選擇盛花期健壯植株，采集樹冠外圍中上部含苞待放的花蕾，用消過毒的鑷子去掉花瓣和花萼，只留花藥。將采集的花藥迅速投入電鏡固定液中，室溫固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存。固定好的樣品經(jīng)0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min；用0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）配制的1%鋨酸室溫避光固定1～2 h；用0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。樣本依次浸泡30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精，每次15 min，之后用乙酸異戊酯浸泡15 min。將樣本放入二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀（Quorum，型號：K850）內(nèi)干燥（將CO2通入臨界點(diǎn)干燥儀，保持15 min，之后置換3～5 次，升溫至臨界溫度（35℃），然后放氣即可）。將干燥后的樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上，放入離子濺射儀（HITACHI，型號：MC1000）樣品臺上噴金30 s 左右。在掃描電子顯微鏡（HITACHI，型號：SU8100）下觀察。

計數(shù)：選擇較為典型的清晰視野進(jìn)行觀察，并拍照保存。分別在300 倍觀察花粉整體效果、3 500 倍觀察花粉赤道面和極面、12 000 倍下觀察花粉外壁紋飾特征，并測量赤道軸長（E）、極軸長（P）、網(wǎng)孔直徑（D）和網(wǎng)脊寬度（W）。

花粉描述：參考葉蔭民等［4-6］的方法，對牛肉紅朱橘和惠水金錢橘的花粉進(jìn)行描述，P＜25 μm 為小型花粉，25 μm＜P＜50 μm 為中型花粉，50 μm＜P＜100 μm 為大型花粉?；ǚ坌螤钜訮/E 表示，其中0.88＜P/E＜1.14 為圓球形，1.14＜P/E＜1.33 為近長球形，1.33＜P/E＜2 為長球形，P/E＞2 為超長球形。每個品種隨機(jī)選取20?；ǚ哿＿M(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的測量和統(tǒng)計，用SPSS 軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.2 花器官結(jié)構(gòu)及花粉育性觀察 取正常發(fā)育的花朵觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。將花藥置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，待其爆出花粉，收集花粉置于干燥離心管中密封。用毛筆蘸取花粉抖落在載玻片上，滴加醋酸洋紅染液，混合均勻后蓋上蓋玻片，染色20 min，用濾紙從邊緣吸干多余染液，置于顯微鏡下觀察，每個品種統(tǒng)計1 000 個以上花粉粒，計算被染成紅色的花粉占整個花粉數(shù)的百分比。

將培養(yǎng)基（0.8% 瓊脂＋16% 蔗糖＋10 mg/L 硼酸）滴在載玻片上，冷卻后用毛筆蘸取花粉抖落在培養(yǎng)基上，將載玻片放入帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子，置于26～28℃培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察萌發(fā)率，以花粉管長度超過花粉直徑為花粉發(fā)芽的標(biāo)志，每個品種5個重復(fù)，每個重復(fù)選取10個視野。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉形態(tài)

從表1、圖1 看出，牛肉紅朱橘和惠水金錢橘的花粉形態(tài)相差不大，牛肉紅朱橘的花粉粒略大于惠水金錢橘。牛肉紅朱橘的花粉以單粒形式存在，花粉粒較小，圓球形，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長圓形，極軸長21.13 μm，赤道軸長23.73 μm，極軸長/赤道軸長為0.89。惠水金錢橘的以單粒形式存在，花粉較小，圓球形，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長圓形，極軸長20.91 μm，赤道軸長22.09 μm，極軸長/赤道軸長為0.95。

圖1 牛肉紅朱橘和惠水金錢橘花粉形態(tài)掃描電鏡觀察結(jié)果

表1 牛肉紅朱橘和惠水金錢橘的花粉形態(tài)特征

牛肉紅朱橘和惠水金錢橘花粉外壁均屬于網(wǎng)狀紋飾，即由凸起的網(wǎng)脊和網(wǎng)眼組成，牛肉紅朱橘網(wǎng)眼直徑0.34 μm，網(wǎng)脊寬0.71 μm?；菟疱X橘的網(wǎng)眼直徑0.34 μm，網(wǎng)脊寬0.77 μm。二者網(wǎng)眼大小相差不大，網(wǎng)眼成淺穴狀或兼具不規(guī)則小穿孔，網(wǎng)眼數(shù)量較稀疏，一般為圓形或橢圓形，分布不均勻，網(wǎng)脊寬度牛肉紅朱橘稍小。二者的萌發(fā)器官均為孔溝類型，即花粉壁表面同時存在溝和孔，具有被子植物的典型特征?？诇暇鶠?個，均沿極軸方向等距離環(huán)狀分布。

2.2 花器官結(jié)構(gòu)及花粉育性

牛肉紅朱橘和惠水金錢橘的花器發(fā)育正常（圖2），開花時雌、雄蕊已成熟。花瓣均呈乳白色，多為5 瓣，花萼杯狀，淺綠色，雄蕊平均19～22 枚，雄蕊和柱頭的長度關(guān)系滿足正常自然授粉的條件。

圖2 惠水金錢橘（左）和牛肉紅朱橘（右）花器官結(jié)構(gòu)

醋酸洋紅染色法染色20 min后的染色情況見圖3，離體花粉固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的萌發(fā)情況見圖4。從表2 看出，牛肉紅朱橘、惠水金錢橘花粉染色率分別為93.95%和95.45%，二者花粉活力均較高且沒有明顯差異；花粉離體萌發(fā)率分別為71.25% 和54.62%，牛肉紅朱橘的花粉離體萌發(fā)率明顯高于惠水金錢橘。

圖3 牛肉紅朱橘（左）和惠水金錢橘（右）花粉染色情況

表2 花粉醋酸洋紅染色法染色率與花粉離體萌發(fā)率

3 討論

花粉的形態(tài)特征受基因控制，具有極強(qiáng)的遺傳保守性，其中包含著大量信息，可為植物的系統(tǒng)分類提供依據(jù)［7-8］。有研究表明，根據(jù)果樹花粉形態(tài)特征差異，可對果樹進(jìn)行種和品種的分類以及鑒別［9-10］，琯溪蜜柚和紅肉蜜柚的花粉形態(tài)和花粉外壁紋飾比較一致，表明親緣性較近［11］。果實(shí)色澤品質(zhì)差異受環(huán)境的影響較大，彭志軍等［12］通過AFLP 技術(shù)從DNA 水平上揭示野生型（金錢橘）與變異體（牛肉紅）的差異。本研究從花粉形態(tài)學(xué)方面比較牛肉紅朱橘及其親本惠水金錢橘的差異，結(jié)果顯示，二者花粉形狀和外壁紋飾差異不大，驗(yàn)證了二者的親緣關(guān)系較近。

葉蔭民等［4］對金柑屬、枳屬和柑橘屬20個品種的花粉觀察發(fā)現(xiàn)，柑橘花粉以長圓球形和近長球形為主，大部分有4條孔溝，其中，朱橘花粉較小，網(wǎng)眼小，脊寬，萌發(fā)孔兩端小。武曉曉等［13］利用掃描電鏡對不同種屬柑橘花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描觀察發(fā)現(xiàn)，寬皮柑橘花粉形狀主要為近長球形，大部分有4 條孔溝，外壁為網(wǎng)狀紋飾或細(xì)網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)脊普遍較寬。牛肉紅朱橘和惠水金錢橘的花粉粒以單粒形式存在，較小，形狀為圓球形，外壁為網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)脊寬，網(wǎng)眼小并呈陷點(diǎn)狀，萌發(fā)溝4條，狹縫狀且中部擴(kuò)大，與上述研究結(jié)果基本吻合。

花粉敗育是某些柑橘品種單性結(jié)實(shí)的原因，也是致使某些柑橘品種產(chǎn)量降低的重要因素，研究花粉育性對柑橘生產(chǎn)和育種工作具有重要意義［14-17］。周之珞等［16］對建陽桔柚的花器官構(gòu)造、花粉育性授粉后花粉的萌發(fā)生長特性及胚胎早期發(fā)育規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，花粉育性較低可能是建陽桔柚無核或少核的原因之一。余楊等［17］從花粉育性、成熟胚囊結(jié)構(gòu)以及胚胎發(fā)育情況等方面對南豐蜜橘無核成因分析發(fā)現(xiàn)，南豐蜜橘花粉育性不高是其無核現(xiàn)象的原因之一，胚胎早期敗育是導(dǎo)致南豐蜜橘無核的主要原因。牛肉紅朱橘花器官完整，雄蕊和柱頭長度無明顯差異，花粉體外萌發(fā)率為71.25%，花粉活力較高，達(dá)93.95%，可育性高，據(jù)此推斷花粉育性與果實(shí)少核或無核現(xiàn)象之間的關(guān)系不甚緊密。因此，仍需對其胚囊結(jié)構(gòu)和胚胎發(fā)育情況進(jìn)行觀察與分析，以便進(jìn)一步探究少核或無核現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

4 結(jié)論

牛肉紅朱橘及其親本惠水金錢橘的花粉形態(tài)差異不大，花粉粒小，圓球形，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長圓形，外壁為網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)脊寬，網(wǎng)眼小，萌發(fā)溝4條，呈狹縫狀，兩端小中間略寬。二者花器官發(fā)育均正常，為完全花，花粉活力較高，牛肉紅朱橘花粉體外萌發(fā)率較高。