關 鵬 萬雙雙 郭玥彤 楊文靜 郭佳帥 高國粉 常彥忠* 于 鵬*

（河北師范大學生命科學學院，石家莊050024）

鐵是人體必需的微量元素，在眾多生理生化過程中發(fā)揮著重要的生物學功能。鐵在DNA 的合成與修復、蛋白質的合成與折疊、電子傳遞、能量代謝、細胞增殖與分化等細胞代謝過程中發(fā)揮著至關重要的作用。鐵缺乏可以引起缺鐵性貧血和兒童神經系統(tǒng)疾病，而當機體內的鐵超過了正常的鐵存儲機制負荷時，過多的鐵可以催化自由基產生并對細胞產生氧化應激損傷，從而引起血色素沉著癥、神經退行性疾病及衰老相關的疾?。?］。因此，機體存在著嚴格的鐵代謝調節(jié)機制，以確保體內鐵含量始終處于正常生理水平。鐵調素（hepcidin）是調控機體鐵代謝的關鍵分子，主要促進目前唯一已知的鐵排出蛋白——膜鐵轉運蛋白（ferroportin1，FPN1） 的內化降解，從而減少腸道的鐵吸收和巨噬細胞儲存鐵的釋放進入血液循環(huán)［2］。由此可見，hepcidin 表達調控是治療鐵代謝紊亂疾病的潛在靶點。

鐵是紅細胞成熟過程中合成血紅蛋白必不可少的原料，紅細胞生成的速度是決定鐵吸收量的重要因素。早在1994年，Finch［3］就提出可能存在響應紅細胞生成需求而調控鐵的激素。到2014 年，Kautz 等［4］首次確認erythroferrone（ERFE）可以調控hepcidin的表達，是連接紅細胞生成和鐵代謝調控的重要分子。本文對ERFE 的發(fā)現、分子結構、功能，以及分子靶向治療等方面的研究進展綜述如下。

1 ERFE的發(fā)現

失血和低氧均能刺激腎上腺髓質合成與分泌促紅細胞生成素（EPO），使骨髓生成紅細胞的數量增加。紅細胞的大量生成導致對鐵的需求增多，機體通過抑制肝臟合成與分泌hepcidin，動員循環(huán)鐵用于骨髓中紅細胞發(fā)育所用。雖然EPO 抑制hepcidin 的作用已經明確，但是體外研究顯示，EPO并不直接抑制肝細胞中hepcidin的表達［5］，表明EPO 在調控hepcidin 時可能還有一個分子橋接。2014 年，Kautz 等［4］發(fā)現機體失血引起Fam132bmRNA 增多，這一變化與血清中EPO 的含量變化相一致；直接給予EPO 可以引起Fam132bmRNA更加快速地增多，表明Fam132b 可能受EPO 的直接 調 控， 后 來 將 Fam132b 命 名 為 ERFE（erythroferrone）。近年來對ERFE 作用的機制研究發(fā)現，ERFE 主要通過與肝臟骨形態(tài)形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）I型受體結合，阻斷BMP/SMAD 信號通路從而抑制hepcidin轉錄［6］。

2 ERFE的結構特征

ERFE 是由Fam132b基因編碼的糖蛋白，由于其C端含有球狀的C1q結構域，故屬于C1q/TNF相關蛋白（C1q/TNF-related protein，CTRPs）家族，與早前報道的CTRP15和肌聯素（myonectin）蛋白是同一個分子［7-8］，肌聯素最初是在骨骼肌細胞中發(fā)現的與脂代謝相關的調控因子。小鼠和人類ERFE 基因同源性很高，其編碼區(qū)序列全長均為10 kb左右，包含8個外顯子，分別位于小鼠1號染色體和人類2號染色體上［9］。

人ERFE 蛋白含354 個氨基酸，小鼠ERFE 蛋白含340 個氨基酸，兩者相似度達到71%。ERFE蛋白有5 個結構域［10］，有4 個Cys 殘基和4 個潛在N-連接的糖基化位點：從N 端開始1～24 氨基酸是信號肽；第25～96 位氨基酸是N 端結構域1；第97～114 位氨基酸為含有6 個甘氨酸-X-Y（X、Y 代表任意一種氨基酸）重復序列的膠原結構域；第115～190位氨基酸為N端結構域2；第191～340位氨基酸構成一個與C1q/TNF 同源的C 端球形結構域（圖1）。C 端的TNF 區(qū)域在不同物種間高度保守，是調節(jié)hepcidin 的一個重要區(qū)域。ERFE 蛋白常以三聚體、六聚體或高分子量低聚物的形式分泌，分泌過程與蛋白質N端的糖基化修飾有關。4個保守的半胱氨酸與ERFE 的多聚化相關，Cys273 和Cys278對于ERFE蛋白的正確折疊很重要，任一位點被丙氨酸取代均可抑制蛋白質分泌；而Cys142或Cys194 被丙氨酸取代可增強蛋白質分泌，表明在內質網的滯留促進了ERFE 寡聚物的組裝［11］。ERFE 還含有2 個PCSK3/furin 識別位點［8］，所以ERFE 蛋白加工后可能以多種剪接異構體形式存在，但是關于不同剪接形式的ERFE蛋白的多聚化調控及其功能目前還不清楚。

Fig.1 Schematic representation of the ERFE protein domain structure（modified from reference［7-8］）圖1 ERFE的蛋白質結構預測圖（修改自文獻［7-8］）

3 ERFE的分布和功能

機體在受EPO刺激時，ERFE是由網織紅細胞分泌并表達的。給予小鼠外源性的EPO，或放血引起內源性的EPO 增加均可以促進ERFE 表達。Kautz 等［4］發(fā)現，EPO 以JAK2/STAT5 依賴的方式促進ERFE蛋白的表達增加。此外，骨骼肌、平滑肌、心臟、腦、腸等組織器官也可產生ERFE。ERFE在機體中發(fā)揮著重要的作用。一方面，ERFE可以調節(jié)糖代謝和脂代謝，是機體感知營養(yǎng)狀態(tài)的一種感應因子；另一方面，ERFE 可以抑制hepcidin 的分泌，通過增加鐵攝取和動員儲存鐵進入血液從而滿足紅細胞生成中鐵的需求。研究發(fā)現，ERFE在地中海貧血小鼠體內顯著增加，并表現出EPO水平升高，肝臟hepcidin表達下降，網織紅細胞數量增加等特征［12］，推測EPO 刺激了網織紅細胞分泌ERFE，進而抑制肝臟hepcidin的分泌，從而增加鐵的供應。

3.1 ERFE對糖脂代謝的調節(jié)

Li 等［13］研究發(fā)現，2 型糖尿病患者和糖耐量異常患者ERFE 水平顯著升高，并且ERFE 水平與體脂含量、甘油三酯、空腹血糖、糖負荷后2 h 血糖、空腹胰島素、糖化血紅蛋白等指標呈正相關，表明ERFE參與糖脂代謝。葡萄糖或游離脂肪酸均能夠促進體外培養(yǎng)的肌細胞分泌ERFE，灌胃葡萄糖和脂質能夠增加小鼠血清中ERFE的水平，提示ERFE是機體感知糖脂狀態(tài)的一種感應因子［7］。同時，ERFE 也和胰島素敏感性相關，Yang 等［14］認為，高脂或高糖引起的胰島素抵抗可能通過PI3K/p38-MAPK 信號通路在轉錄水平抑制ERFE；而Lim 等［15］推測，ERFE 可能通過影響線粒體DNA參與胰島素抵抗的調節(jié)。除了參與糖代謝，ERFE還可以通過抑制脂肪分解或促進游離脂肪酸的吸收來降低循環(huán)系統(tǒng)內游離脂肪酸水平。并且，高脂飲食上調ERFE 蛋白的表達僅與高脂食物本身有關，而與小鼠的肥胖狀態(tài)無關。Gamas 等［16］發(fā)現，ERFE可以在體外培養(yǎng)的脂肪細胞和肝細胞中通過上調與游離脂肪酸吸收相關的蛋白CD36、脂肪酸轉移蛋白（FATP1）、Cav1 和脂肪酸結合蛋白（FABP）的表達來促進游離脂肪酸的吸收。綜合來看，ERFE將骨骼肌與肝臟和脂肪組織中的體內脂穩(wěn)態(tài)聯系起來，揭示了能量平衡的改變可能與ERFE介導的糖脂代謝紊亂有關。

3.2 ERFE在EPO調控hepcidin通路中的作用

ERFE 作為應激激素，在急性紅細胞生成刺激下迅速降低肝臟hepcidin的表達。當然，也有觀點認為長期的EPO刺激才是肝臟hepcidin表達下降的原因。比如，在急性大出血或者溶血性疾病中，EPO可以刺激網織紅細胞分泌ERFE進入血液，并通過抑制肝臟hepcidin 的分泌，從而增加鐵攝入，供應血紅蛋白生成中鐵的需求，使得紅細胞的水平恢復正常。Subramaniam 等［17］發(fā)現，EPO 與受體的結合可以降低C/EBPα 與Hamp的啟動子結合進而降低hepcidin 的表達。有研究指出，ERFE 可以捕獲BMP，通過阻擋BMP 配體與其相關受體的結合減弱hepcidin的表達［6］。表面等離子體共振研究證實了ERFE 能與BMPs 蛋白家族成員結合，發(fā)現ERFE 與BMP2、BMP6 及BMP2/6 異二聚體的結合力 最 強［6，18］。此 外，EPO 也 可 以 通 過 降 低SMAD1/5/8 的磷酸化水平來下調hepcidin 的表達［19］。BMP/SMAD 信號途徑位于調控hepcidin 表達的上游，是鐵代謝調節(jié)的關鍵通路。作為轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族成員，BMPs參與了細胞增殖、分化和凋亡等生命活動［20］。BMP與受體結合后激活SMAD1/5/8并使它們磷酸化，而后與SMAD4形成復合物進入細胞核內，激活hepcidin 的轉錄和表達［20］。當BMP/SMAD途徑異常激活時，EPO不再促進ERFE的產生，但是由于BMP/SMAD 途徑對hepcidin 的激活作用大于ERFE 對hepcidin 的抑制作用，所以總體上hepcidin 仍然表達升高。只有抑制BMP/SMAD信號途徑時，ERFE 對hepcidin 的抑制作用才得以顯現［21］。當完全阻斷BMP/SMAD 信號通路時，ERFE 對hepcidin 的抑制作用也會消失［22］。Wang等［19］培育了肝臟特異性敲除SMAD1/5 的小鼠模型，發(fā)現ERFE 對該小鼠肝臟hepcidin 的表達沒有抑制作用。這些結果表明，ERFE 對hepcidin 的抑制作用至少在一定程度上依賴于BMP/SMAD 信號通路。Arezes 等［22-23］進一步證實，ERFE 與BMP6結合并抑制BMP/SMAD 信號通路引起的hepcidin表達。綜合以上觀點，EPO、ERFE 和hepcidin 三者的關系可以看成，ERFE作為EPO的應答蛋白會參與EPO對hepcidin的調控。

3.3 ERFE在轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）調控hepcidin通路中的作用

ERFE是一種EPO應答蛋白，而EPO的變化受到TfR2 的影響。細胞鐵攝取蛋白TfR2 與TfR1 有很高的相似度，均可以與攜帶鐵的轉鐵蛋白（holo-transferrin，holo-Tf）結合［24］。但是，含鐵Tf與TfR1的結合力遠高于與TfR2的結合力，而含鐵Tf 與TfR2 的結合在低鐵水平時也能達到飽和，而結合了TfR2 的Tf 就會通過ERK 通路穩(wěn)定hepcidin的轉錄，從而上調hepcidin的表達。因此，TfR2可以監(jiān)控機體鐵的含量［25］。除此以外，TfR2與EPO 受體形成復合物參與調節(jié)紅細胞的生成，是紅細胞與鐵代謝關聯的關鍵位點之一。正常的情況下，當鐵充足時，攜帶了鐵的Tf 與TfR2 的結合會使網織紅細胞中的EPO 受體穩(wěn)定表達［26］，促使紅細胞大量的生成。同時，肝細胞中的TfR2 又促進hepcidin大量的生成，減少鐵的攝入。而當鐵缺乏時，Tf 不足以與TfR2 結合，使得EPO 作用于幼紅細胞時不能促進紅細胞的大量生成；為了達到正常供氧量，機體產生了紅細胞生成的欲望，使得幼紅細胞生成的ERFE 作用于肝細胞來抑制hepcidin的生成［24］。

由于TfR2 可以穩(wěn)定成紅細胞表面的EPO 受體從而促進紅細胞生成［27］，所以TfR2 對于ERFE 有間接性的調節(jié)作用。那么與之相似的TfR1 又會有什么作用呢？Tf 是鐵代謝中運輸鐵的主要轉運分子，在生理狀態(tài)下，機體循環(huán)中鐵會結合30%的Tf 來發(fā)揮作用［28］。在病理狀態(tài)下，如地中海貧血等，機體會產生大量的鐵，而過多的鐵超出了Tf的運轉能力導致血漿內不穩(wěn)定的鐵（labile plasma iron，LPI）大量增多，從而導致機體出現一系列的病理現象［29-30］。那么，如果增加機體中Tf 的含量是否就可以解決這一問題呢？人為地增加空載的Tf 可以減少TfR1 的表達從而促進紅細胞的成熟。有文獻報道，增加Tf 的量使得機體中的LPI 減少，可以改變病理情況中機體在產生大量紅細胞時鐵供應不足的現狀，減少體內LPI所引起的毒性，進而改善鐵引起的氧化應激損傷［30］。同樣，如果減少機體中與含鐵Tf 相結合的TfR1 量，可以引起hepcidin升高，病理現象也會得到改善。

4 ERFE與臨床疾病

由于ERFE 對于hepcidin 有抑制作用，所以ERFE可能作為治療缺鐵性疾病的潛在靶點。

4.1 ERFE與地中海貧血

在β-地中海貧血的患者中，ERFE 含量的升高可能是導致機體hepcidin降低的主要原因。地中海貧血是由于β-珠蛋白的突變而引起的有效紅細胞生成過程受阻所致［31］。該病患者體內鐵超負荷，因鐵累積在多個組織中造成細胞毒性而引發(fā)組織損傷［32］?；颊叩闹饕Y狀是紅細胞前體呈凋亡狀態(tài)，體內生命周期短的無效紅細胞大量生成［33］，因而造成血液攜帶氧氣的能力下降。為了保證正常的供氧量，機體EPO 含量升高，促進紅細胞生成，進而維持紅細胞攜帶和運輸氧氣的作用，使機體供氧充足。紅細胞生成中需要大量的血紅素，因而機體需要更多的鐵來參與血紅素的合成；此時，巨噬細胞可以吞噬生存周期短的紅細胞將其中的鐵再次排出進入血液循環(huán)［34］；與此同時，機體生成紅細胞過程中，有核幼紅細胞ERFE 分泌增多，抑制hepcidin 表達從而導致FPN1 表達量升高，腸道上皮細胞鐵攝取和吸收逐漸增加，造成鐵在組織內的聚集。ERFE 可以抑制hepcidin 的分泌，然而在地中海貧血小鼠敲除Fam132b基因后的研究發(fā)現，與單純地中海貧血小鼠相比，此雙敲除小鼠hepcidin 受抑制的情況得到改善，恢復到了正常水平，肝臟鐵水平下降，但是貧血癥狀并未改善，血清鐵水平更加下降，紅細胞體積更小，呈更嚴重鐵限制性紅細胞生成的特征［4，35］。但也有研究從ERFE 抗體著手，發(fā)現靶向N 端結構域的抗ERFE抗體可以阻斷ERFE 與BMP6 的結合，從而阻止EPO誘導的hepcidin抑制作用，并改善β-地中海貧血模型小鼠的鐵積聚和貧血［18，36］。在減少鐵的同時，抗體治療還使紅細胞、血紅蛋白和血細胞比容增加，網織紅細胞數量、平均紅細胞體積和細胞分布寬度減少，從而改善無效的紅細胞生成。但ERFE 抗體處理的β-地中海貧血模型小鼠的肝臟鐵未降低至野生型小鼠的水平，這可能是由于在給予ERFE 抗體之前肝臟的鐵積累和/或由于增加的hepcidin 不足以完全抑制飲食鐵的吸收。有趣的是，盡管新生小鼠已經存在完整的EPO/ERFE/hepcidin調控軸［37］，但是成年大鼠較幼年地中海貧血大鼠的脾臟ERFE 水平更高，對肝臟hepcidin 的抑制也更有效，表明EPO/ERFE/hepcidin 調控軸的作用具有年齡差異［38］。

4.2 ERFE與慢性腎臟疾病（CKD）

野生型小鼠注射熱滅活的布魯氏桿菌會產生炎性貧血，血紅蛋白降低，肝臟和骨髓中ERFE表達顯著增加；而Fam132b基因敲除會加劇小鼠炎癥、hepcidin 水平升高和更嚴重的貧血，這表明ERFE可能會通過抑制hepcidin和增加鐵的利用，有助于小鼠從炎癥性貧血中恢復［18，39］。貧血是慢性腎臟疾病患者重要的并發(fā)癥之一，在血液透析患者中更為常見［40］。慢性腎臟疾病的進展過程中，細胞因子及炎癥介質增多、EPO 產生減少、骨髓對EPO反應減弱、血液丟失過多、紅細胞壽命縮短等因素均會加重腎性貧血的進展［41］。慢性腎臟疾病患者的鐵攝入不足和低水平的EPO 是貧血發(fā)生、發(fā)展的主要原因。由于血液中的hepcidin水平受腎臟功能、鐵狀態(tài)和炎癥的影響，因此慢性腎臟疾病患者鐵代謝的調節(jié)非常復雜［42］。Spoto 等［43］在一項針對1 123 名血液透析患者和745 名慢性腎臟疾病的研究中，對血清ERFE的水平和死亡率以及非致死性心血管疾病的關系進行了分析。研究發(fā)現，血液透析患者的血液ERFE水平與血清鐵和鐵蛋白呈負相關。在745 名慢性腎臟疾病患者中有126 名死亡或經歷了非致命性心血管事件；在單變量Cox回歸分析中，血清ERFE升高2μg/L意味著死亡和非致死性心血管事件的風險增加3%；在多因素Cox 回歸分析中校正了年齡、煙塵、白蛋白、磷酸鹽、血紅蛋白和本身的心血管疾病，證實血清ERFE與死亡率和非致死性心血管事件的關聯仍然顯著相關；在59 名血液透析患者中確實觀察到ERFE 和hepcidin水平之間呈負相關［44］。另有研究發(fā)現，慢性腎臟疾病透析患者的血清ERFE水平高于非透析慢性腎臟疾病患者和健康人［42］。當給予慢性腎臟疾病透析患者外源性的EPO 治療后，患者產生的ERFE 增多。因此，ERFE 可能在抑制慢性腎臟疾病患者的hepcidin異常增加方面具有重要作用。

4.3 ERFE是一種心臟保護激素

在命名ERFE之前，myonectin在心臟功能中的研究就已經有報道［8］。myonectin 基因敲除和超表達小鼠進行心肌缺血-再灌注損傷研究發(fā)現［45］，myonectin 敲除小鼠心肌細胞凋亡更嚴重，而myonectin 超表達小鼠心臟損傷減弱，表明myonectin在心肌細胞在缺血-再灌注損傷中具有保護作用。Myonectin基因敲除小鼠心肌缺血-再灌注損傷后，促炎基因表達水平和心肌梗死面積的大小均顯著增加。小鼠骨骼肌內myonectin 基因超表達會通過減少心肌細胞凋亡而降低心肌缺血-再灌注損傷，但是心肌保護的機制還并不十分清楚。盡管BMP 信號通路對ERFE抑制hepcidin非常重要，但是BMP 與myonectin 的相關性還不是十分清楚，myonectin的作用機制研究也很緩慢。

4.4 ERFE檢測在基礎研究和臨床檢測中的應用

4.4.1 競技性運動中ERFE可作為生物標志物

在國際和國內競技性體育運動中，為了維護比賽的公正性、保護運動員的身心健康，檢測參賽人員是否使用過興奮劑以求提高運動成績一直以來是各級體育組織的關注焦點。歷史上，促蛋白合成代謝類固醇常用于提高成績，但是其代謝物易于在尿液中檢測到。而紅細胞輸血尤其是比賽前輸入運動員自己的血液，及注射促紅細胞生成試劑（比如EPO）等［8］改變的是血液學指標比如紅細胞比例、血紅蛋白濃度等的變化，這加大了檢測的難度。曾經有研究建議檢測血液內鐵水平、鐵蛋白和hepcidin 水平的變化，尤其是hepcidin 的表達變化早于血液學指標的變化，受血漿鐵水平的負調控和受炎癥的正調控，可以作為一個很有用的生物標志物［46］。但是，hepcidin的表達受到多種不同的信號轉導通路調控。自ERFE 發(fā)現以來，由于具有和hepcidin 一樣的檢測靈敏度，而且EPO 刺激下ERFE變化早于hepcidin并位于其表達調控的上游，因此ERFE可能被視為一個新的可用于檢測血液興奮劑的生物標記物［8］。

4.4.2 人血液中ERFE的免疫檢測

2017 年，兔單克隆抗體的三明治型免疫印跡檢測了臨床上人血清中的ERFE［47］，來自健康成年人志愿者血液樣本、EPO處理后的老年貧血病人、β-地中海貧血病人（輸血或不輸血）、健康成年人放血后的樣本，血清hepcidin水平下降。利用免疫印跡方法檢測ERFE水平，結果發(fā)現，未輸血及輸血前的β-地中海貧血病人ERFE水平增加，輸血后的ERFE 水平下降，進一步證實了ERFE 與血清hepcidin 水平間的負相關性。利用單克隆抗體檢測人ERFE 的免疫檢測試劑盒可在Intrinsic LifeSciences公司購買。

4.4.3 小鼠ERFE免疫檢測

美國Silarus Therapeutics 公司開發(fā)了用小鼠單克隆抗體檢測鼠類EREF 的酶聯免疫檢測試劑，Ganz教授實驗室［8］改良了此檢測試劑，用DELFIA 報告系統(tǒng)代替了HRP 的顯色系統(tǒng)。Intrinsic LifeScience 試劑公司也可以用多克隆抗體檢測小鼠ERFE，在檢測中，健康雄性C57BL/6 小鼠的ERFE水平太低不容易檢測到，但是Hbbth3/+的β-地中海貧血小鼠模型中ERFE含量多，因而能檢測到。現在也有許多其他試劑，但需要更多的研究驗證方能證明數據的可行性。

5 總結與展望

近年的研究已經證實，ERFE 可以通過調節(jié)hepcidin 的表達維持機體鐵穩(wěn)態(tài)和紅細胞的生成。在機體大量失血或EPO 刺激下，骨髓中有核幼紅細胞中ERFE 蛋白表達增加，繼而通過BMP/SMAD 等信號轉導通路降低肝臟內hepcidin 的合成，進而減弱hepcidin-FPN1 軸對鐵釋放的抑制作用，從而腸道的鐵吸收增加和巨噬細胞鐵釋放增多，導致血液內鐵水平增加，有更多的鐵可用于血紅素和血紅蛋白的合成，加速紅細胞生成，緩解失血或貧血的病理狀態(tài)，最終使機體恢復到正常水平（圖2）。因此，EPO/ERFE/hepcidin-FPN1軸在鐵代謝和紅細胞生成中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

Fig.2 The diagram of the relationship among erythroferrone，hepcidin and erythropoiesis圖2 ERFE、hepcidin和紅細胞生成關系模式圖

對于hepcidin 與ERFE 之間關系的深入研究能進一步了解紅細胞的生成與鐵代謝之間的關系，從而為貧血等多種疾病提供更為有效的診斷和治療手段［48］。所有的脊椎動物基因組內均存在ERFE，不同物種間ERFE序列存在保守性［8］，鑒于前期研究Fam132bmRNA 在多組織器官的不同程度的表達［4］，ERFE 在心臟保護和爪蟾發(fā)育中功能的研究，說明ERFE在生命維持正常的生理功能中發(fā)揮著重要的作用。但是，至今關于ERFE在哺乳動物胚胎發(fā)育、心血管功能、十二指腸吸收、骨骼肌生物功能以及在神經系統(tǒng)發(fā)育和功能中的作用及機制等還存在著很多的未知之處。ERFE在小腸和神經系統(tǒng)鐵代謝通路調控的深入研究還有望為鐵代謝紊亂疾病的防治提供理論基礎。