馬亦波 馬東南 郭俊明**

（1）寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科，寧波 315020；2）寧波大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所，浙江省病理生理學技術研究重點實驗室，寧波 315211）

胃癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一［1］。2020 年胃癌新發(fā)病例108.9 萬例，死亡76.9萬例，分別占全部癌癥病例和死亡人數(shù)的5.6%和7.7%；胃癌發(fā)病率居世界各類腫瘤第5位，死亡率居各類腫瘤第4 位［2］。東亞是胃癌的高發(fā)地區(qū)，2020 年胃癌新發(fā)病例占全球新發(fā)病例總數(shù)的60.3%［2］。早期胃癌（early gastric cancer，EGC）通常沒有特定的癥狀，并且經(jīng)常與其他消化系統(tǒng)疾病的癥狀相混淆。當癥狀明顯時，胃癌已進入后期階段。因此，尋找EGC標志物顯得很有必要。

1979 年，Hsu 等［3］使用電子顯微鏡觀察到真核生物細胞質中的環(huán)狀RNA （circular RNA，circRNA）。circRNA最初被認為是mRNA剪接錯誤的副產(chǎn)品［4］。近年來，研究人員已經(jīng)證明了circRNA不是簡單的錯誤剪接產(chǎn)生的，而是在人類細胞中廣泛存在的具有生物學功能的RNA分子［5］。此外，許多研究表明，circRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用［6-8］。與傳統(tǒng)標志物不同，circRNA 作為一種潛在的診斷、預后或預測標志物，因其高度特異性而備受關注。近些年來，circRNA 的合成機制與功能已逐漸被闡明，關于circRNA 與胃癌關系的研究也已展開，許多circRNA被發(fā)現(xiàn)在胃癌患者組織和正常組織間存在較大差異，一些胃癌相關circRNA在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調控作用［7-8］。因此，circRNA可能成為胃癌的潛在診斷標志物和治療新靶點。

1 circRNA生物合成的機制

目前，大多數(shù)circRNA 是通過對前體mRNA（pre-mRNA）進行反向剪接而產(chǎn)生的，它們沒有3＇端和5＇端［9］。根據(jù)其組成，circRNA可分為外顯子-內(nèi) 含 子 circRNA （exon-intron circular RNA，EIciRNA）［10］、外 顯 子circRNA （exonic circular RNA，ecircRNA）［9，11］和內(nèi)含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）［12］。ecircRNA 和EIciRNA的形成方式包括（圖1）：a.內(nèi)含子配對驅動的環(huán)化［11］：pre-mRNA上游和下游的內(nèi)含子通過互補的堿基序列形成包含外顯子的ecircRNA 或包含外顯子與內(nèi)含子的EIciRNA；b.套索驅動的環(huán)化或外顯子跳躍［13］：pre-mRNA被剪接時，下游外顯子的3＇剪接受體和上游5＇剪接供體之間形成反向共價連接的套索結構，其中包含外顯子和內(nèi)含子，通過進一步移除內(nèi)含子后外顯子通過磷酸二酯鍵形成ecircRNA； c. RNA 結 合 蛋 白（RNA binding protein，RBP）依賴的環(huán)化［14］：pre-mRNA 外顯子兩端的上下游內(nèi)含子通過可供RBP 識別的序列來與RBP 特異性結合形成二聚體，環(huán)化形成EIciRNA；若移除內(nèi)含子后，則最終可形成ecircRNA。d. ciRNA 不同于ecircRNA，它包含一個獨特的2＇-5＇鏈接，它的形成與內(nèi)含子兩端7 nt的GU 豐富元件和11 nt 的C 豐富元件相關。內(nèi)含子GU 豐富元件和C 豐富元件的兩端環(huán)化形成一個不包含外顯子的、擁有不同長度尾巴的套索RNA 結構，去除尾部分支后生成ciRNA。另外，Schmidt等［15］最近在后生動物中發(fā)現(xiàn)了一種古老、保守的RNA環(huán)化機制，涉及tRNA內(nèi)含子的剪接。這種剪接機制完全獨立于前述mRNA的剪接機制。

Fig.1 The models of circRNAs’circularization圖1 circRNA的環(huán)化模型

2 circRNA的生物學功能

隨著研究的深入，circRNA的生物學功能逐漸被揭示，以下分5個方面分別闡述（圖2）。

2.1 circRNA充當miRNA海綿

大部分的circRNA主要存在于細胞質中。已有大量的研究發(fā)現(xiàn)，定位于細胞質中的circRNA可以與mRNA競爭微RNA（microRNA，miRNA）的靶向結合位點，充當miRNA 海綿，從而調控mRNA的表達［9，16］。在可充當miRNA海綿的circRNA中，最典型的是ciRS-7 （circular RNA sponge for miR-7）［16］。ciRS-7 含有超過70 個保守的miR-7 結合位點；并且在細胞中高豐度表達，在每個細胞中大概能吸附兩萬多個miR-7，因此可以與mRNA競爭miR-7的結合位點，從而影響其表達水平［9］。另一個作為miRNA 海綿的circRNA 是雄性性別決定基因（sex-determining region Y，Sry）的睪丸特異性轉錄物，它含有miR-138 的16 個保守結合位點［16］。胃癌相關circRNA 和miRNA 之間的相互作用是近年來的研究熱點，不過由于大多數(shù)circRNA在體內(nèi)表達較低，所以它們作為miRNA 分子海綿的影響有限。

2.2 circRNA與RBP結合

許多circRNA可以與RBP形成復合物，從而調節(jié)特定的蛋白質發(fā)揮功能［17-20］。研究表明，circFoxo3 能夠與多種RBP（如缺氧誘導因子和局部黏著斑激酶等）結合影響細胞應激和衰老進程［17］。circFoxo3 可以通過與周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）和P21 相互作用來抑制細胞周期，將細胞阻滯在G1/S 期［18］。另外， 研究人員發(fā)現(xiàn)， 胃癌相關circRNA circAGO2 表達上調，與患者預后不良有關。circAGO2 與人類抗原R（human antigen R，Hur）蛋白相互作用，促進Hur mRNA 3＇端非翻譯區(qū)的激活和富集，從而減少與AGO2的結合，抑制AGO2/miRNA介導的與胃癌進展相關基因的沉默［19］。相關circRNA表達的增強會促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。例如，Wang 等［20］實驗證明，在胃癌細胞核中circ_SMAD4 可以與T 細胞因子4（T cell factor 4，TCF4）相互作用，然后將TCF4 募集到β1 連環(huán)素（catenin beta 1，CTNNB1）基因的啟動子上，增強CTNNB1 的轉錄，而β1 連環(huán)素具有調節(jié)細胞生長和細胞黏附的作用，該基因突變可能是導致胃癌的重要原因之一。

2.3 circRNA參與調控轉錄

定位于細胞核的一些circRNA 可以調控轉錄。例如，circ-EIF3J 和circ-PAIP2 與U1 小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP） 結合，進一步與RNA 聚合酶Ⅱ相互作用，促進親本基 因 的 轉 錄［10］。另 外，Zhang 等［12］發(fā) 現(xiàn) 有 些ciRNA 可反饋調控其親本基因的表達，如：ci-ankrd52 堆積到其轉錄位點，激活RNA 聚合酶II發(fā)揮正調控轉錄作用。這表明ciRNA 對其親本編碼基因具有順式調控作用。最近還有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌相關circRNA也具有調控轉錄的作用，如：Ding等［21］發(fā)現(xiàn)沉默circ-DONSON 抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。具體機制是circ-DONSON 通過與核小體重塑因子（nucleosome-remodeling factor，NURF）復合物相互作用，將復合物募集到SRY框轉錄因子4（SRY-box transcription factor 4，SOX4）基因啟動子上，并啟動其轉錄，而SOX 4能促進胃癌的增殖和轉移。

2.4 circRNA影響同源線性mRNA的形成

Ashwal-Fluss等［22］發(fā)現(xiàn)在pre-mRNA的剪接過程中，有些circRNA 通常是通過剪接競爭即circRNA的反向剪接機制和mRNA的常規(guī)線性剪接的互相競爭，以犧牲典型的mRNA為代價產(chǎn)生的，從而降低同源線性mRNA的表達。這表明circRNA的生物發(fā)生可能是mRNA 產(chǎn)生的重要調節(jié)因素之一。

2.5 circRNA發(fā)揮翻譯作用

Yang等［23］研究發(fā)現(xiàn)，N-6-腺苷甲基修飾（指在RNA 分子的A 堿基的第6 位N 上加上一個甲基基團，m6A）作為RNA 最豐富的堿基修飾，可啟動人體細胞中一些circRNA翻譯成蛋白質。在深入研究后發(fā)現(xiàn)，這種m6A驅動的翻譯需要真核翻譯啟起因子4G2（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2，eIF4G2）和m6A 讀碼器——含YTH 結構 域 蛋 白3 （YTH domain-containing protein 3，YTHDF3）， 并 被 甲 基 轉 移 酶 樣 3 和 14（methyltransferase-like 3 and 14，METTL3/14） 增強；而被去甲基化酶——肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）抑制。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，參與肌肉發(fā)生過程中的circ-ZNF609也可直接翻譯成蛋白質［24］。circ-ZNF609通過內(nèi)部核糖體插入元件、以帽子非依賴方式翻譯成蛋白質。這些最近的發(fā)現(xiàn)不僅拓展了人們對circRNA功能的認識，而且為circRNA在疾病診治中的應用提供了新思路。因此，根據(jù)是否具有翻譯功能，circRNA 可分為編碼 circRNA 和非編碼circRNA［25］。

3 circRNA在胃癌診治中的價值

目前胃癌研究的首要目標是建立早期診斷和有效治療的新方法以提高胃癌患者的生存率。circRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已被證明其是胃癌的潛在診斷標志物、治療靶點，以及與胃癌耐藥有關。

3.1 circRNA作為胃癌診斷的生物標志物

circRNA具有穩(wěn)定性和半衰期長等特點，可作為胃癌診斷的分子標志物［26］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多circRNA在胃癌組織、患者血漿和外泌體中的水平異 常 變 化（表1）。 Ma 等［27］研 究 發(fā) 現(xiàn)，circPTPN22 在胃癌組織、胃癌細胞和胃癌患者血漿中表達上調，并與腫瘤轉移呈正相關，可作為胃癌診斷的生物標志物。Xu 等［28］研究證明，血漿circ_0004771在胃癌患者和復發(fā)患者中均有不同程度的上調，提示血漿circ_0004771可作為胃癌診斷的一種新的生物標志物。最近還有研究進一步發(fā)現(xiàn)了包括hsa_circ_0007766［29］、hsa_circ_0141633［30］、hsa_circ_102958［31］、 hsa_circ_0067582［32］和hsa_circ_0065149［33］在內(nèi)的一些circRNA在胃癌組織和患者血液中都有不同程度的變化，且受試者操作特性曲線（receiver operating curve，ROC）下面積（area under ROC， AUC） 值 較 大， 其 中hsa_circ_0141633 的AUC 值達到0.835，且靈敏度（0.845）和特異度（0.936）較高，明顯高于臨床上常用的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和 糖 類 抗 原19-9 （carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）［34］；hsa_circ_0007766 和hsa_circ_102958的AUC 值分別為0.704 和0.74，均高于CEA 和CA19-9 的AUC 值［29，31］；另外hsa_circ_0067582 的AUC 值為0.694，且其靈敏度（0.667）和特異度（0.613）高于CA19-9 的靈敏度和特異度［32］。這些實驗數(shù)據(jù)提示，circRNA可能是潛在的胃癌診斷標志物。另外，本課題組首次研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0065149 的表達在胃癌中顯著下調，與腫瘤直徑、神經(jīng)侵襲和胃癌患者總生存期顯著相關［33］。更重要的是，早期胃癌患者血漿外泌體中hsa_circ_0065149比傳統(tǒng)的胃癌標志物具有更高的敏感性和特異性，提示可作為早期胃癌的篩查標志物。Zhang 等［35］的 研 究 結 果 顯 示，胃 癌 組 織 中hsa_circ_0026344 水平與腫瘤大小、淋巴結轉移和腫瘤-淋巴結-轉移（tumor node metastasis，TNM）分期等臨床病理因素顯著相關；此外，hsa_circ_0026344低表達患者的總體生存率明顯低于高表達患者，是胃癌預后的一個潛在的生物標志物。

Table 1 circRNAs may be used in the diagnosis of gastric cancer表1 有希望用于診斷胃癌的circRNA

3.2 circRNA作為胃癌治療新靶點

circRNA與胃癌細胞增殖、分化、侵襲和遷移相關，有希望成為胃癌治療的潛在新靶點（表2）。例如：胃癌組織中過表達的hsa_circ_0000467 通過miR-326-3p 海綿作用在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起調控 作 用［36］。Wang 等［37］研 究 發(fā) 現(xiàn)，hsa_circ_0001772（circRBM33）通過miR-149/IL-6 軸上調白介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平，進而調控胃癌細胞的增殖。轉錄因子特異性蛋白1（specificity protein 1，Sp1）參與調節(jié)腫瘤進展相關信號通路相關基因的表達，在胃癌中過表達，其表達與胃癌的轉移潛能和預后不良有關。Zhang等［38］發(fā)現(xiàn)，miR-527 可與Sp1 mRNA 相互作用，抑制Sp1 表達；而作為miR-527 海綿的hsa_circ_0005529 在胃癌組織中上調，通過miR-527/Sp1 信號軸上調Sp1的水平，促進胃癌的生長和轉移。Li等［39］研究發(fā)現(xiàn)，泛素特異性蛋白酶3（ubiquitinspecific protease 3，USP3）過表達促進了胃癌細胞的遷移和增殖，miR-224-5p與USP3 mRNA相互作用可降低USP3 的表達，而胃癌細胞中hsa_circ_0017639 表達上調，通過miR-224-5p/USP3 軸調節(jié)USP3 表達水平，參與胃癌的進展。另外，有一些研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001947、hsa_circ_0004104、circCYFIP2、 circPIP5K1A、 circ-RanGAP1、 circ-MAT2B 和hsa_circ_0001829 均 可 通 過circRNAmiRNA-mRNA 軸來調控胃癌的發(fā)生、發(fā)展［40-46］。這說明，如果有效抑制這些致癌性circRNA的高表達，可能是未來胃癌分子治療一種新的方法。

另外，一些胃癌相關的抑癌性circRNA也被發(fā)現(xiàn)。例如，腫瘤轉移抑制因子1 （metastasis suppressor 1，MTSS1）在許多癌癥中起抑癌作用，Li等［47］實驗發(fā)現(xiàn)沉默MTSS1基因促進胃癌細胞增殖和遷移，而hsa_circ_002059通過抑制miR-182和誘導MTSS1 表達抑制胃癌細胞增殖和遷移。Hu 等［48］發(fā)現(xiàn)miR-3200-5p 可以直接與磷脂酰乙醇胺結合蛋白1 （phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）mRNA 結合，而PEBP1 已被認為是參與胃癌增殖和侵襲的主要調控因子之一；circMTO1 通過miR-3200-5p/PEBP1 軸調控PEBP1水平發(fā)揮抗癌作用。P21活化激酶3（P21-activated kinase 3，PAK3）作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是小Rho GTP 酶 的 主 要 下 游 效 應 因 子［49］。Wang等［50］發(fā)現(xiàn)，PAK3 的表達增加會導致胃癌細胞增殖和轉移能力下降，并證實了hsa_circ_0000190 通過miR-1252海綿作用，上調PAK3水平從而抑制胃癌的進展。

有趣的是，國際上關于circRNA調控胃癌的發(fā)生發(fā)展也有廣泛的研究。例如，最近美國的一項研究利用酶連接步驟合成了第一個抗核酸酶酶解的含有多個miR-21 結合位點的人工circRNA 海綿［51］。miR-21 有多個下游靶分子，其中死亡域相關蛋白（death domain associated protein，DAXX）是關鍵的腫瘤抑制蛋白，可以抑制胃癌細胞增殖；這些人工circRNA 海綿通過抑制miR-21 對其下游靶蛋白的活性從而抑制胃癌細胞增殖。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，沉默circNF1 可抑制胃癌細胞增殖和遷移［52］。circNF1與miR-16結合，從而調節(jié)其下游的目標蛋白——微管相關蛋白7 （microtubule-associated protein 7，MAP7）和AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶3（AKT serine/threonine kinase 3，AKT3）的翻譯水平［52］。MAP7 是一種微管相關蛋白，主要在上皮細胞中表達，是細胞分裂、增殖和分化所必需的；磷酸化AKT3 信號途徑參與細胞增殖和分化等過程，所以，circNF1可以通過miR-16海綿作用調控胃癌細胞的增殖和分化［52］。上述這些研究強調了circRNA作為胃癌治療靶點的潛力。

3.3 circRNA影響胃癌細胞的耐藥性

順鉑（cisplatin）是臨床應用最為廣泛的一種抗癌藥物，但近年來順鉑耐藥性的產(chǎn)生降低了順鉑的實際療效，甚至導致胃癌化療的失?。?3-54］。因此研究順鉑耐藥機制是目前胃癌研究領域的重點之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，有多種circRNA調控胃癌細胞對順鉑的耐藥性（表3）。Yes 相關蛋白1 （Yesassociated protein，YAP1）的高表達與胃癌的不良預后和胃癌順鉑耐藥有關，而Yao 等［55］發(fā)現(xiàn)，降低YAP1表達可抑制胃癌細胞對順鉑的抗性，順鉑耐藥的胃癌患者血清和胃癌細胞的外泌體circ-PVT1 通過miR-30a-5p/YAP1 軸調節(jié)胃癌細胞的自噬、侵襲和凋亡，促進胃癌細胞對順鉑耐藥。Peng等［56］通過基因敲除和過表達實驗發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞對順鉑耐藥與circCUL2調控miR-142-3p/ROCK2軸有關。Rho 相關激酶2（Rho-associated kinase 2，ROCK2）與胃癌細胞增殖和遷移有關，而ROCK2過表達抑制胃癌細胞自噬可增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。Zhang 等［57］通過體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001313 在胃癌細胞對順鉑耐藥中的機制是調控miR-618/BCL2 影響細胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，circ_0110805 影響胃癌細胞對順鉑敏感與其通過miR-299-3p 調控內(nèi)皮蛋白-二硫鍵異構酶（endothelial protein-disulfide isomerase，ENDOPDI）表達有關［58］。ENDOPDI在胃癌組織和細胞中高表達，具有抑制胃癌細胞凋亡并促進細胞增殖、遷移和侵襲等作用，此外還可抑制胃癌細胞對順鉑的敏感性。Deng 等［59］最新研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中circVAPA 的表達較正常組織明顯上調，circVAPA缺失抑制了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增加了細胞凋亡。在順鉑耐藥SGC-7901/DDP 細胞株中circVAPA、STAT3 和STAT3 下游基因的表達上調。STAT3 基因敲除可阻斷circVAPA 過表達誘導的順鉑處理SGC-7901/DDP 細胞的增殖，而circVAPA基因敲除可減弱胃癌細胞對順鉑的耐藥性。從機制上來說，circVAPA能夠通過miR-125b-5p/STAT3信號通路促進胃癌的化療耐藥和惡性進展。上述這些研究結果為今后胃癌順鉑耐藥的研究提供了新方向。

Table 3 circRNAs associated with drug resistance in gastric cancer表3 與胃癌耐藥相關的circRNA

4 總結和展望

如上所述，circRNA具有穩(wěn)定性好、半衰期長等特點，作為miRNA 海綿、親本基因轉錄調控作用以及與RBP 結合等參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移等過程，已展現(xiàn)出作為胃癌標志物和治療靶點的潛力。目前，臨床中使用的胃癌標志物的診斷效率不夠理想。如果將circRNA作為胃癌的標志物用于臨床，可能有助于解決現(xiàn)有標志物的靈敏度低、不穩(wěn)定和低特異性等問題。但是，circRNA在胃癌診斷上也具有一些缺點。首先，檢測circRNA比現(xiàn)有檢測方法更昂貴，這限制了circRNA作為生物標志物的廣泛使用；其次，使用circRNA進行胃癌診斷的可靠性仍然需要被大樣本實驗驗證。同時，circRNA作為胃癌治療靶點也存在一些問題。在探索circRNA與胃癌的關系中，大部分研究關注的還是相關circRNA的海綿作用上。然而，并不是所有circRNA 都具有海綿作用，只有少數(shù)circRNA 對某些miRNA 具有豐富的結合位點，而且其調控胃癌的可靠性還亟需更多的實驗數(shù)據(jù)來驗證。另外，目前發(fā)現(xiàn)的關于胃癌相關circRNA的轉錄調控作用和翻譯作用還較少。

雖然目前對circRNA功能有了初步的了解，但仍需要深入地研究其分子機制，特別是有關circRNA應用于胃癌治療的臨床前研究的結果非常少見。未來還需要明確circRNA與胃癌發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系，進一步闡明circRNA 與miRNA 或RBP 的調控網(wǎng)絡，深入挖掘circRNA的作用機制。顯然，要做到真正地把circRNA應用于臨床，還有很長的路要走。但是，相信在不久的將來，隨著研究的深入，無論是胃癌的早期診斷、治療還是預后評估，circRNA將會得到廣泛的應用。