張乃心 許程志 吳運(yùn)譜 喬傳玲** 陳化蘭

（1）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069；2）遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，沈陽(yáng) 110847）

流感病毒是一種多節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，主要分為A、B、C 和D 4 種類型。A 型流感病毒（influenza A virus，IAV）的研究最為廣泛，IAV的基因組全長(zhǎng)約13 500 bp，包含8 個(gè)基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和NS）（圖1），可以編碼至少20 種蛋白質(zhì)［1］，其中參與先天免疫逃逸的蛋白質(zhì)主要有NS1、PB1-F2 和PA-X 蛋白。IAV感染宿主廣泛，禽、豬、人、馬、蝙蝠及海洋哺乳動(dòng)物等均可被IAV感染。IAV感染的主要靶組織是宿主的上呼吸道和肺泡上皮細(xì)胞，使得機(jī)體氣體交換失敗，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。

Fig.1 Structure diagram of influenza virus圖1 流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖

在與宿主共同進(jìn)化的過(guò)程中，IAV不時(shí)地引起季節(jié)性流行或世界性大流行。流感病毒生存能力強(qiáng)的原因主要有兩個(gè)方面：a.IAV不同亞型間基因片段的重組［2］；b.在天然免疫的壓力下，IAV演變出一系列逃避病毒中和抗體的識(shí)別和免疫清除的策略。因此，了解IAV 如何設(shè)法逃逸宿主的天然免疫，對(duì)于有效監(jiān)測(cè)流感病毒的抗原變異、病毒防控和致病機(jī)制研究顯得尤為重要。

1 IAV感染引起的宿主先天性免疫應(yīng)答

當(dāng)IAV入侵宿主呼吸道后，天然免疫反應(yīng)被迅速啟動(dòng)。天然免疫系統(tǒng)是由物理屏障、先天性免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、干擾素等組成［3］。先天性免疫機(jī)制雖然應(yīng)答速度快，但缺乏特異性和記憶性。天然免疫系統(tǒng)通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors， PRRs） 識(shí) 別 病 原 相 關(guān) 分 子 模 式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），啟動(dòng)抗病毒級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活轉(zhuǎn)錄核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB） 和干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF），從而導(dǎo)致干擾素（interferon，IFN）等的生成、先天免疫細(xì)胞的招募或程序性細(xì)胞死亡的激活。

IAV可以被多種PRRs識(shí)別（圖2）。首先，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs） 中的TLR3、TLR7/8 分別可以識(shí)別內(nèi)噬體中的dsRNA 和ssRNA［4-5］，隨后招募和活化TRIF、MyD88接頭分子。TRIF 依賴性途徑直接招募TRAF3 和TRAF6。TRAF6 通過(guò)多泛素化激活RIPK1，又經(jīng)磷酸化激活TAK1，導(dǎo)致NF-κB、IRF7和AP1的激活和核易位。TRAF3 通過(guò)多泛素化激活I(lǐng)KK 激酶復(fù)合物，然后通過(guò)磷酸化激活I(lǐng)KKε/TBK1，導(dǎo)致IRF3 的激活和核易位。經(jīng)MyD88 依賴性途徑進(jìn)行的信號(hào)傳遞通過(guò)多泛素化與TRAF6 激活TAK1，TAK1 活化后經(jīng)磷酸化激活I(lǐng)KK 激酶復(fù)合物和MAPK 激酶，導(dǎo)致NF-κB、IRF7 和AP1 的激活和核易位［6］。最終各途徑在細(xì)胞核內(nèi)編碼I型、III型干擾素和促炎性細(xì)胞因子。RIG-I 樣受體（RIG-I-like receptors，RLRs）大部分存在于細(xì)胞質(zhì)，有一小部分定位于細(xì) 胞 核［7］。RNA 解 旋 酶 結(jié) 構(gòu)（RNA helicase domain，helicase）是RIG_I的一個(gè)功能區(qū)，特異性識(shí)別10～19 bp 的較短dsRNA。RIG-I 樣受體可使線粒體抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出caspase 活化與招募功能區(qū)（caspase activation and recruitment domain，CARD）［8］?；罨腗AVS 可以與TRAF3 結(jié)合，TRAF3 通過(guò)多泛素化激活RIPK1，然后通過(guò)磷酸化激活I(lǐng)KK 激酶復(fù)合物，直接導(dǎo)致NF-κB的激活及核易位，或通過(guò)IKKε/TBK1 導(dǎo)致IRF3、IRF7 的激活及核易位［9-10］。值得注意的是，核內(nèi)RIG-I識(shí)別了核內(nèi)vRNPs后發(fā)生寡聚化，并在細(xì)胞核和線粒體膜之間的鄰近區(qū)域與MAVS相互作用，從而誘導(dǎo)抗病毒信號(hào)通路［11］。NOD 樣 受 體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）中NLRP3 炎性小體被IAV 激活時(shí)可以促進(jìn)IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌［12］。其可以主要通過(guò)以下3 種方式激活：a. 通過(guò)IAV dsRNA 激 活Pro-IL-1β、Pro-IL-18 和Procaspase-1［13］；b. 通過(guò)M2 離子通道觸發(fā)Pro-IL-1β和Pro-IL-18 的剪切［14］；c.通過(guò)在巨噬細(xì)胞溶酶體中IAV PB1-F2蛋白的積累［15］。

Fig.2 Schematic diagram of host innate immune response caused by influenza A virus圖2 IAV感染引起的宿主先天性免疫應(yīng)答示意圖

包漿蛋白Z-DNA 結(jié)合蛋白1（Z-DNA binding protein 1，ZBP1）作為先天免疫領(lǐng)域的新星，其可誘導(dǎo)IAV感染過(guò)程中程序性細(xì)胞死亡途徑、炎癥小體激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Kuriakose 等［16］認(rèn)為ZBP1 蛋白可以識(shí)別胞質(zhì)中的NP 和PB1 蛋白。ZBP1 蛋白的Zα2 結(jié)構(gòu)域識(shí)別了胞質(zhì)中的IAV RNA后可以在感染的細(xì)胞中引發(fā)多種反應(yīng)［11］：ZBP1蛋白的RHIM 結(jié)構(gòu)域可以與絲氨酸激酶RIPK1 和RIPK3 相互作用，ZBP1-RIPK1 通路可導(dǎo)致NF-κB的活化及核易位；ZBP1-RIPK3 通路可使得MLKL磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡；ZBP1-RIPK3-RIPK1-FADD-caspase8通路可以激活NLRP3炎性小體，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［16-17］。

干擾素主要分為3 種類型，其中I 型干擾素α、β和III型干擾素λ 在天然免疫抑制IAV病毒的復(fù)制中發(fā)揮極其重要的作用［18］。分泌出的干擾素作用于同一細(xì)胞的干擾素受體（interferon receptors，IFNR） 啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，級(jí)聯(lián)反應(yīng)依賴于Jak1、Tyk2、STAT1 和STAT2 的磷酸化復(fù)合物。最終結(jié)果是與干擾素調(diào)節(jié)因子9 （interferon regulatory factor，IRF9）組成干擾素刺激基因因子3（IFNstimulated gene factor-3 transcription factor complex 3，ISGF3）［19］，ISGF3 的激活可以直接刺激下游干擾素誘導(dǎo)反應(yīng)中300多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。

2 IAV利用自身蛋白質(zhì)逃避宿主天然免疫應(yīng)答

2.1 PB1-F2蛋白

Fig.3 Multifunctional schematic diagram of PB1-F2 protein圖3 PB1-F2蛋白多功能示意圖

IAV 的聚合酶蛋白PB1 有2 個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），其中第二個(gè)ORF編碼輔助蛋白——PB1-F2蛋白［20］的羧基端可以結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，產(chǎn)生多種先天免疫逃逸機(jī)制（圖3）：a. PB1-F2 蛋白與MAVS 結(jié)合使線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）坍塌，抑制RIG-I-TRIM25介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路，降低I型干擾素的轉(zhuǎn)錄［21］；b. 在某些情況下核點(diǎn)蛋白NDP52 （nuclear dot protein 52， NDP52） 與PB1-F2 蛋白的結(jié)合力強(qiáng)于MAVS，在感染的早期可以負(fù)向影響TBK1 誘導(dǎo)的信號(hào)通路（IRF3/IRF7激活），I 型干擾素生成受阻［22］，感染后期MAVS不再被降解并保持活性，積累的MAVS 可以激活NF-κB信號(hào)通路，加劇I型干擾素的產(chǎn)生［23］；c.PB1-F2 蛋白通過(guò)與線粒體膜腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3 （adenine nucleotide translocator 3，ANT3）和電壓依賴性陰離子通道蛋白1（voltage dependent anion channel 1，VDAC1）結(jié)合［24］，破壞線粒體完整性，釋放細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyto C），加快對(duì)感染細(xì)胞的促凋亡作用［25］，增強(qiáng)病毒粒子的釋放；d. PB1-F2 蛋白可以作為自噬受體通過(guò)Tom40 通道進(jìn)入線粒體內(nèi)膜間隙，使得MMP 下降［26］，同時(shí)與線粒體蛋白TUFM 及LC3B 相互作用，誘導(dǎo)線粒體自噬從而加速M(fèi)AVS 降解，抑制I型干擾素的產(chǎn)生［27］；e. H7N9 亞型禽流感病毒PB1-F2 蛋白增加線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）和Ca2+的外流激活NLRP3 炎性小體，造成IL-1β 產(chǎn)生過(guò)多處于失衡狀態(tài)，細(xì)胞因子風(fēng)暴加強(qiáng)了IAV 感染對(duì)宿主的損傷［28］，而且PB1-F2 的缺失會(huì)導(dǎo)致IL-6、IL-1β 和IL-8 的表達(dá)顯著增加［29］。因此，PB1-F2 蛋白可以在多種信號(hào)水平上調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)，研究PB1-F2 蛋白的天然免疫逃逸機(jī)制可為IAV的預(yù)防和控制提供新的線索和策略。

2.2 NS1蛋白

Isaacs 等［30］第一次發(fā)現(xiàn)了IAV 的“反向干擾”現(xiàn)象，而這種“反向干擾素”就是IAV NS1 蛋白。NS1蛋白是IAV非常重要的多功能先天免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，其氨基端有一個(gè)RNA 結(jié)合功能域（RNA binding domain，RBD），羧基端有一個(gè)效應(yīng)功能域（effect domain，ED），可以通過(guò)多靶點(diǎn)多方式同時(shí)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中影響宿主的先天性免疫反應(yīng)（圖4）。

Fig.4 Multifunctional schematic diagram of NS1 protein圖4 NS1蛋白多功能示意圖

首先，泛素化是激活RIG-I 通路的必要條件。例如H5N1亞型豬流感病毒ED功能域EALQR基序天然缺失，EALQR 基序?qū)τ贜S1 維持穩(wěn)定的二聚體和與RIG-I競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合dsRNA至關(guān)重要。該基序的缺失使得NS1蛋白不能阻斷TRIM25寡聚化和泛素化，進(jìn)一步削弱了對(duì)TRIM25 介導(dǎo)的RIG-I 泛素化的抑制作用，從而減弱了RIG-I信號(hào)通路中對(duì)干擾素的抑制作用［31］。但B 型流感病毒的NS1 蛋白不能與RIG-I 相互作用，并且其RBD 功能域與TRIM25的相互作用阻斷了ED功能域?qū)IG-I泛素化的抑制作用［32］。其他RIG-I介導(dǎo)的負(fù)責(zé)病毒識(shí)別的因子也會(huì)受到NS1蛋白的抑制，如ATF-2/c-Jun、IRF3 和NF-κB 等的激活和易位。所以通過(guò)抑制RIG-I 的泛素化從而促進(jìn)病毒的復(fù)制，是流感病毒進(jìn)行免疫逃逸的一種新機(jī)制。NS1 蛋白與NLRP3炎性小體結(jié)合可以損害含有Caspase-1 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like containing a caspase-recruitment domain，ASC）的形成及泛素化，負(fù)面影響IL-1β 和IL-18水平，為病毒免疫逃逸另一個(gè)策略［33-34］。NS1蛋白與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）的p85β 亞基相互作用［35］，PI3K 的激活對(duì)于病毒的有效復(fù)制非常重要，增加了流感病毒內(nèi)化速率、抑制細(xì)胞凋亡［36］。

其次，NS1 蛋白對(duì)宿主細(xì)胞核內(nèi)mRNA 的轉(zhuǎn)錄、加工和運(yùn)輸過(guò)程有抑制作用。這種抑制作用可通過(guò)3 種方式完成：a.感染早期，30-ku 亞單位腺苷酸化特異因子（cleavage and polyadenylation specificity factor 30，CPSF30）和聚合A結(jié)合蛋白II（poly A binding protein II，PABII）［37-38］可以阻斷pre-mRNA的加工和mRNA的核輸出，導(dǎo)致宿主基因表達(dá)的普遍抑制［39］。進(jìn)化后的馬流感病毒（equine influenza virus，EIV）NS1蛋白還可以干擾JAK/STAT通道，特異性阻斷ISG的誘導(dǎo)［40］；b.作為干擾素誘導(dǎo)的一種核孔蛋白，Nup98可與mRNA輸出因子對(duì)接，導(dǎo)致mRNA 出核障礙，允許IAV的高度復(fù)制［41］；c.H3N2亞型人流感病毒的NS1蛋白含有一種獨(dú)特的ARSK 尾序列，可與人PAF1轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物 （human PAF1 transcription elongation complex，hPAF1C）結(jié)合，因?yàn)閔PAF1C是抗病毒反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，所以導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄延伸受阻［42］。

不僅如此，NS1蛋白也可以阻礙干擾素誘導(dǎo)基因（IFN-induced genes，ISGs）的表達(dá)。由于RBD功能域與 2＇-5＇ 寡腺苷酸合成酶（2＇-5＇oligoadenylate synthetase，OAS）的相互作用勝于與dsRNA 的相互作用，可以通過(guò)抑制OAS/RNase L 的活性來(lái)保護(hù)病毒RNA 不被降解［43］。NS1 蛋白結(jié)合蛋白激酶R（protein kinase R，PKR），導(dǎo)致PKR 活性降低，阻斷eIF2α 磷酸化［44］，抑制宿主抗病毒的狀態(tài)。此外，NS1 能與eIF4F 的大亞基真核啟動(dòng)因子4GI （eukaryotic translation initiation factor 4GI，eIF4GI） 結(jié)合，優(yōu)先增強(qiáng)流感病毒mRNA 的翻譯［45］。核因子90 蛋白（nuclear factor 90-protein，NF90）的抗病毒活性是通過(guò)調(diào)節(jié)NS1蛋白對(duì)PKR 磷酸化的抑制作用和感染細(xì)胞中應(yīng)急顆粒的形成而實(shí)現(xiàn)的［46］。H3N2亞型豬流感病毒的NS1 蛋白ED 功能域可以與干擾素誘導(dǎo)蛋白35（interferon inducible protein 35，IFI35）高效結(jié)合，使RIG-I 免受IFI35 介導(dǎo)的K48 連接泛素化，但在H7N9亞型禽流感病毒中IFI35發(fā)揮了相反作用［47］。總體來(lái)講，在IAV的天然免疫逃避策略中，NS1蛋白所扮演的角色非常重要，是作用靶點(diǎn)和作用方式最多的干擾素拮抗蛋白，其不僅可以拮抗干擾素和細(xì)胞因子通路，還參與病毒復(fù)制的各個(gè)過(guò)程。

2.3 聚合酶復(fù)合體

在IAV聚合酶復(fù)合體中，PB2蛋白是IAV致病的主要決定因素之一［48］，其可定位于線粒體中。TRIM35是TRAF3的調(diào)節(jié)因子，雖然IAV PB2蛋白可抑制TRAF3 的K63 泛素化連接，但TRIM35 可直接介導(dǎo)K48泛素化連接并降解IAV PB2蛋白，激活RIG-I抗病毒信號(hào)保護(hù)宿主免受IAV感染［49］。但不同亞型IAV的PB2蛋白與線粒體的結(jié)合能力有所差異，特別是禽流感病毒的PB2蛋白定位于非線粒體［50］。PB2 蛋白與PB1-F2 作用機(jī)制相似，不同的是PB1-F2 在通過(guò)MMP 和/或TUFM 與MAVS 互作抑制干擾素啟動(dòng)子激活的同時(shí)，還可以增強(qiáng)PB1和PB2蛋白的干擾素拮抗功能［21］。

IAV 的PB1、PA 和NP 蛋白也具有干擾素拮抗功能。PB1 和NP 蛋白分別可以與TRIM32、TRIM22 結(jié)合降低聚合酶活性［51-52］。已有研究表明，宿主DDX21 RNA解旋酶是通過(guò)結(jié)合PB1蛋白和阻礙聚合酶的組裝抑制病毒蛋白質(zhì)的合成［53］；而且NS1蛋白的RBD功能域與DDX21相互作用也可調(diào)控病毒基因的表達(dá)［54］。PA蛋白氨基端具有核酸內(nèi)切酶活性，可以通過(guò)阻斷IRF3 的磷酸化和二聚化，導(dǎo)致IRF3 在細(xì)胞質(zhì)中積累，抑制干擾素β的產(chǎn)生［55］。作為一種干擾素誘導(dǎo)基因，抗黏病毒蛋白A（myxovirus resistant protein A，MxA）可以和PB2、NP 蛋白結(jié)合抑制病毒的轉(zhuǎn)錄［56-57］。但是H7N9亞型的NP蛋白卻是RIG-I受體介導(dǎo)的陽(yáng)性調(diào)節(jié)蛋白，上調(diào)I型干擾素的產(chǎn)生，可使病毒復(fù)制能力減弱［58］。

2.4 病毒編碼的其他蛋白質(zhì)

在流感病毒編碼的多種蛋白質(zhì)中，其余的蛋白質(zhì)是否也參與以及通過(guò)怎樣的方式進(jìn)行天然免疫逃逸還需進(jìn)一步探索。

PA-X 蛋白作為一種輔助蛋白，可以利用宿主的RNA Xrn1酶降解宿主細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄子，促進(jìn)病毒的復(fù)制［59-60］，但具體機(jī)制尚且不清楚。PA-X蛋白不僅降解細(xì)胞mRNA［61］，還可以降解病毒dsRNA 以逃避多種PRRs 的識(shí)別［62］。在感染早期，PA-X蛋白還通過(guò)RIG-I-MAVS途徑防止I型干擾素mRNA 在肺內(nèi)的積累［63］。作為一種小分子離子跨膜蛋白，M2 蛋白也是一種精密的調(diào)節(jié)因子：a.可固定在線粒體上，增加細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平并產(chǎn)生ORS，導(dǎo)致自噬的激活，從而調(diào)控MAVS介導(dǎo)的信號(hào)通路［64］；b.M2 和NP 蛋白可以通過(guò)熱休克蛋白40 （heat shock protein 40， hsp40） 蛋 白 促 進(jìn)p58IPK 蛋白（58 ku inhibitor of PKR，p58IPK）的釋放，間接抑制PKR 的活性，促進(jìn)了病毒粒子的釋放［65-66］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路可以識(shí)別感染細(xì)胞中高效表達(dá)的HA 蛋白，從而觸發(fā)先天性免疫應(yīng)答。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（endoplasmic-reticulumassociated protein degradation， ERAD） 通 路 因EDEM1、EDEM2和ERManI這3種I型α-甘露糖苷酶的重要參與使得HA蛋白發(fā)生降解［67］。

眾所周知，線粒體自噬也參與IAV 的復(fù)制過(guò)程，但具體的機(jī)制迄今不是十分清楚。NP 和M2蛋白可上調(diào)HSP90AA1 的表達(dá)，HSP90AA1 通過(guò)AKT-mTOR 信號(hào)通路調(diào)控NP 和M2 蛋白介導(dǎo)的自噬，自噬加速病毒聚合酶活性，導(dǎo)致病毒RNA 合成和vRNP核輸出增加，進(jìn)而導(dǎo)致病毒蛋白積累和病毒子代產(chǎn)量的上調(diào)［68］。

3 展 望

本文針對(duì)流感病毒先天免疫反應(yīng)和天然免疫逃逸的策略進(jìn)行了詳細(xì)的論述。眾所周知，宿主的天然免疫對(duì)抗IAV的早期感染是由一個(gè)多層面相互協(xié)調(diào)的復(fù)雜過(guò)程完成的。IAV之所以難以防控，就是因?yàn)樵诿庖邏毫χ?，可以利用自身編碼蛋白和非編碼蛋白產(chǎn)生對(duì)宿主天然免疫系統(tǒng)的各種逃逸策略，平衡自身的生存和宿主的抗病毒反應(yīng)。本文具體闡述了IAV 的PB1-F2、NS1、PA-X 等蛋白質(zhì)在抗病毒先天免疫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制，但是IAV的聚合酶蛋白及其他蛋白質(zhì)是如何調(diào)控先天信號(hào)通路的，目前還不完全清楚，還有很多機(jī)制有待進(jìn)一步解析，也意味著這將是未來(lái)一個(gè)有趣的研究方向和探索目標(biāo)。由于病毒的迅速進(jìn)化和逃逸，新亞型病毒及耐藥株的出現(xiàn)使得疫苗和藥物的有效性受到了極大限制。因此，需要利用現(xiàn)有知識(shí)和技術(shù)增強(qiáng)宿主的天然免疫，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)進(jìn)化的IAV來(lái)控制這種疾病。這也助于發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療新靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)和研發(fā)高效、科學(xué)防控流感病毒的藥物和疫苗。