代傳揚(yáng) 管弦樂 秦冠南△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

結(jié)核性腦膜炎(TBM)是由結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血行或直接侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的非化膿性炎癥性疾病，也是肺外結(jié)核中最嚴(yán)重的形式，其發(fā)病率約占結(jié)核患者的10%，致死率、致殘率高[1]。文獻(xiàn)[2]報(bào)道，TBM未經(jīng)治療的患者死亡率接近100%；在接受治療的兒童中，死亡約為20%，另有50%的患者遺留長(zhǎng)期神經(jīng)功能缺損；對(duì)于合并艾滋病者，治療后死亡率約為60%。這既與TBM的早期癥狀不典型，易導(dǎo)致誤診有關(guān)，也與其治療方案尚不統(tǒng)一有關(guān)。TBM作為感染性疾病，抗炎治療是提高其療效的主要手段之一。早在1952年，有學(xué)者[3]提出糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥，從而改善TBM患者預(yù)后。有研究[4-5]表明，糖皮質(zhì)激素能降低TBM患者的短期死亡率，但其他研究指出糖皮質(zhì)激素對(duì)TBM患者的遠(yuǎn)期生存率和致殘率沒有影響[6]。目前應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療TBM仍有爭(zhēng)議，其確切機(jī)制也未完全證實(shí)。因此，本研究通過建立大鼠TBM模型，擬研究糖皮質(zhì)激素對(duì)TBM的治療作用，探討其可能分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療TBM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體(Santa Cruze)， 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)(Abcam)，7H9、7H11培養(yǎng)基(Difco)，ELISA試劑盒(Cusabio Biotech，Newark)，地塞米松磷酸鈉注射液(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)，注射用甲強(qiáng)龍(Pfizer Manufacturing Belgium NV)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv(北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)、清潔、日夜節(jié)律的環(huán)境中，自由覓食。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照(Control)組、結(jié)核性腦膜炎(TBM)組、TBM+地塞米松(DXMS)組和TBM+甲基強(qiáng)的松龍(MSS)組，每組5只。本研究獲得了貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3方法

1.3.1TBM大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)，TBM組、TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠均先建立TBM模型。取在7H9培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2周的結(jié)核分枝桿菌H37Rv，經(jīng)過濾、離心、分散，制成濃度為2.5×106CFU/mL菌懸液，經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.2 mL/只(菌量5×105CFU/只)，置于濕度(55±15)%，(21±2)℃負(fù)壓環(huán)境中，保持12 h燈光/12 h黑暗的循環(huán)，動(dòng)物可以方便地獲取食物和水，14 d后形成結(jié)核性腦膜炎模型[7]。Control組大鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL。

1.3.2糖皮質(zhì)激素治療 TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠在TBM模型建立后分別腹腔注射DXMS 0.4 mg/kg·d及MSS 4 mg/kg·d，TBM組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)一周。在用藥后第7天分別斷頭處死進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)觀察，并與TBM組同期大鼠進(jìn)行比較。

1.3.3腦組織含水量測(cè)定 處死動(dòng)物后，盡快取出腦組織，觀察腦大體標(biāo)本。濾紙吸凈表面血漬后，取左側(cè)大腦半球按Elliott公式計(jì)算含水量：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4HE染色及VEGF、VEGFR1、VEGFR2免疫組織化學(xué)染色 大鼠心臟灌注取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋。取右側(cè)大腦半球中1/3份全層腦組織制片。HE染色后，光鏡觀察腦組織病理變化。進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，98℃加熱30 min進(jìn)行抗原修復(fù)；3%雙氧水室溫封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，5 min/次；滴加馬血清封閉液，室溫20 min，去除多余液體；加入一抗，4℃過夜后，在37℃復(fù)溫45 min；PBS再洗3次，5 min/次；滴加生物素化二抗，37℃ 30 min；PBS洗3次，5 min/次；再加入三抗，37℃ 30 min；最后PBS清洗4次，5 min/次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片、鏡檢；染色結(jié)果閱片由專人單盲進(jìn)行，計(jì)數(shù)每40×高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.5腦組織中炎癥因子的檢測(cè) 取右側(cè)腦組織樣研磨、勻漿后取上清液，按照說明通過ELISA試劑盒測(cè)定上清液中炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的含量。

2 結(jié) 果

2.1腦組織病理形態(tài)改變 糖皮質(zhì)激素治療1周后，肉眼觀察TBM組、TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠腦組織均有不同程度的腫脹，表現(xiàn)為腦溝變淺，腦回增寬，腦膜緊張，腦膜血管擴(kuò)張充血，腦室和腦池等處有較多滲出物。如圖1所示，HE染色100×鏡下可見Control組腦組織細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則；TBM組可見腦膜增厚，腦內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，蛛網(wǎng)膜下腔擴(kuò)張，充血明顯并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與TBM組比較，TBM+DXMS組和TBM+MSS組充血減輕、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，其中TBM+MSS組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕更明顯。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色

2.2腦組織含水量 TBM組腦組織含水量為(93.0±4.8)%，明顯高于Control組(70.6±2.0)%(P<0.05)。TBM+DXMS組和TBM+MSS組腦組織含水量分別為(80.1±2.8)%和(76.7±3.1)%，低于TBM組(P<0.05)，其中TBM+MSS組降低更為明顯(P<0.05)。

2.3VEGF免疫組織化學(xué) TBM組大鼠VEGF和VEGFR2表達(dá)較正常對(duì)照組增加(P<0.05)，而VEGFR1未見明顯變化(P<0.05)。TBM+DXMS組與TBM+MSS組VEGF表達(dá)較TBM組下調(diào)(P<0.05)，VEGFR1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；而TBM+DXMS組與TBM+MSS組VEGFR2表達(dá)與TBM組比較，均未見明顯變化(P>0.05)；TBM+DXMS組與TBM+MSS組上述指標(biāo)間未見明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織VEGF及其受體表達(dá)變化

2.4炎癥因子水平 TBM組、TBM+DXMS組和TBM+MSS組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平較Control組升高(P<0.05)；而TBM+DXMS組、TBM+MSS組上述指標(biāo)均低于TBM組(P<0.05)；以TBM+MSS組顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織炎癥因子檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

糖皮質(zhì)激素在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腦水腫、脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。TBM時(shí)顱內(nèi)常有明顯的炎癥反應(yīng)，理論上糖皮質(zhì)激素可以緩解炎癥，減輕腦組織水腫并降低顱內(nèi)壓，從而減少腦組織的損傷。臨床上也有較多醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)性使用糖皮質(zhì)激素治療TBM，但療效尚不確切[4-6]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素降低了TBM大鼠腦組織的含水量，說明糖皮質(zhì)激素能夠減輕TBM后繼發(fā)的腦水腫。腦水腫是TBM后重要的病理改變，其病理生理機(jī)制可以是血腦屏障的破壞，或是細(xì)胞膜上離子通道的異常。而VEGF具有很強(qiáng)的促進(jìn)病理性血管新生、增加血管通透性的作用，已被證實(shí)與部分疾病時(shí)腦水腫的形成密切相關(guān)[7-9]。但中樞系統(tǒng)感染時(shí)，比如TBM患者的腦水腫發(fā)生是否也與該因子有關(guān)，目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，TBM后大鼠腦組織中VEGF含量增高，說明VEGF也參與了TBM后腦水腫的發(fā)生。VEGF有2種高親和力的受體，VEGFR1和VEGFR2，兩者共同調(diào)控VEGF的病理生理作用。VEGFR1和VEGFR2存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，正常情況下表達(dá)水平很低，但在缺血、缺氧等情況下，血管內(nèi)皮中的VEGFR表達(dá)增高[8]。我們的研究也表明，VEGFR2在TBM后表達(dá)增高。但另一受體VEGFR1的表達(dá)未見明顯變化，這與T.D.Crafts等[8]觀察到的VEGFR變化不一致。我們推測(cè)，這可能與TBM的腦水腫形成機(jī)制與其他疾病不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用激素后，VEGF表達(dá)水平較TBM時(shí)下降，VEGFR1表達(dá)水平升高，而VEGFR2無明顯變化，推測(cè)原因可能是VEGFR2主要表達(dá)于血管內(nèi)皮，VEGF可以通過旁分泌的方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過與VEGFR2結(jié)合，激活PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。而糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，則可能通過增加VEGFR1的表達(dá)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF與VEGFR2的結(jié)合，從而對(duì)VEGF的上述信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

炎癥反應(yīng)是TBM的主要特征之一，TBM的病理生理過程也與多種炎癥因子密切相關(guān)，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等[10-11]。炎癥因子的水平不僅可以用于TBM的輔助診斷，還可以用來判斷患者的治療效果和臨床預(yù)后。本研究也檢測(cè)了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α在TBM后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)TBM后上述細(xì)胞因子明顯增加，而應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后這些細(xì)胞因子明顯降低，提示糖皮質(zhì)激素能夠降低TBM后腦組織中的炎癥因子表達(dá)，減輕TBM后的炎癥反應(yīng)。臨床經(jīng)驗(yàn)使用糖皮質(zhì)激素治療TBM時(shí)，具體用藥選擇目前尚不統(tǒng)一[12-13]。本研究選用了地塞米松和甲強(qiáng)龍兩種類型的糖皮質(zhì)激素進(jìn)行比較，從結(jié)果可以看到，在降低腦組織炎癥及腦水腫方面，甲強(qiáng)龍效果優(yōu)于地塞米松，但二者在VEGF及受體表達(dá)方面未見明顯差異。

綜上所述，糖皮質(zhì)激素能夠減輕TBM大鼠腦水腫的發(fā)生，我們推測(cè)這是通過對(duì)VEGF及其受體的差異調(diào)控降低了血腦屏障通透性；糖皮質(zhì)激素還能減輕TBM大鼠腦內(nèi)炎癥的程度和炎癥因子的表達(dá)；相較于地塞米松，TBM大鼠使用甲強(qiáng)龍后腦水腫及炎癥因子表達(dá)水平下降更為明顯。目前，糖皮質(zhì)激素在TBM的治療中仍有爭(zhēng)議，動(dòng)物模型的研究為糖皮質(zhì)激素在TBM治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但該工作目前尚不完善，今后的研究可以進(jìn)一步完善VEGF配體的檢測(cè)，結(jié)合現(xiàn)有糖皮質(zhì)激素對(duì)VEGF及其受體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更好地解釋糖皮質(zhì)激素在TBM時(shí)腦水腫的作用機(jī)制，并將糖皮質(zhì)激素使用中可能的副作用納入研究。