王婷婷，李妍，張明明，蔣國健，張東偉

急性心肌梗死在全球死因中居于首位，而不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是導(dǎo)致急性心肌梗死的重要誘因［1］。不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的特點(diǎn)主要包括：大量的巨噬細(xì)胞演變成泡沫細(xì)胞并在斑塊中不斷聚集、斑塊中炎癥反應(yīng)的不斷加劇、脂質(zhì)壞死核心面積的持續(xù)擴(kuò)大，最終斑塊破裂導(dǎo)致惡性心血管事件的發(fā)生［2］。雖然大量研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的典型病理過程是大量吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的泡沫細(xì)胞在內(nèi)皮下不斷聚集［1］，然而，如何有效抑制巨噬細(xì)胞對脂蛋白的攝取進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞的形成尚不明確，因此，闡明泡沫細(xì)胞形成的病理機(jī)制、提出增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的干預(yù)策略，是目前心血管醫(yī)生亟需解決的關(guān)鍵問題。

SIRT6主要在組蛋白H3第9位賴氨酸和第56位賴氨酸脫乙?；习l(fā)揮作用［3］，其活性異常參與了心血管疾病、癌癥和糖尿病等多種疾病的病理進(jìn)程［4］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6能夠刺激胰島β細(xì)胞中的胰島素分泌，促進(jìn)ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖代謝［5］。此外，三酰甘油（triacylglycerol，TG）的合成和脂質(zhì)代謝也與SIRT6的活性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6基因被敲除后可以導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞中TG合成增加，而TG的過度積累可導(dǎo)致脂肪肝或肝脂肪變性［6］。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析SIRT6增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機(jī)制，以期為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年12月至2021年12月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級野生型C57BL小鼠10只，鼠齡8周齡，體質(zhì)量25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心；雄性ApoE-/-小鼠20只，鼠齡8周齡，體質(zhì)量25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，SPF級環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～29 ℃；相對濕度控制在40%～70%。構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型所需要的高脂飼料成分包括15%脂肪、1.25%膽固醇、0.2%膽酸鹽。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RAW 264.7巨噬細(xì)胞購自美國ATCC公司。

1.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 ox-LDL購自廣州益源生物科技有限公司，SIRT6抗體（貨號：#8864S）、GAPDH抗體（貨號：#8864S）、CD68抗體（貨號：#26042）、CD36抗體（貨號：#14347）購自美國CST公司，二抗購自西安壯志生物科技有限公司，TUNEL試劑盒購自美國羅氏公司，小鼠麻醉用異氟烷購自河北一品制藥股份有限公司，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司，Ad-SIRT6、Ad-CD36購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)方法 將10只雄性C57BL小鼠作為空白對照組；將20只雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為動(dòng)脈粥樣硬化組和動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，每組10只。采用高脂飼料喂養(yǎng)動(dòng)脈粥樣硬化組和動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠16周以構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型。持續(xù)監(jiān)測各組小鼠血脂指標(biāo)，16周后用異氟烷麻醉并處死各組小鼠，分離小鼠主動(dòng)脈，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)小鼠動(dòng)脈管腔內(nèi)形成了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，視為造模成功。動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組通過尾靜脈注射200 μl滴度為1×109eg/ml的腺相關(guān)病毒（adrenoassociated virus，AAV）-SIRT6，共注射3次，在1周內(nèi)完成注射，以過表達(dá)SIRT6。

1.3.1.2 HE染色檢測各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積干預(yù)16周后，采用異氟烷麻醉并處死小鼠，分離小鼠主動(dòng)脈，取出動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科，包埋后制作石蠟切片，脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，梯度脫水后在顯微鏡下觀察結(jié)果，藍(lán)色代表細(xì)胞核，紅色代表細(xì)胞質(zhì)，通過Image J軟件分析動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積［7］。

1.3.1.3 Masson染色檢測各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量 干預(yù)16周后，采用異氟烷麻醉并處死小鼠，分離小鼠主動(dòng)脈，取出動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科，包埋后制作石蠟切片，脫蠟至水，將切片置于Bouin液中固定10～15 min，用Harris蘇木素染色4～5 min，流水下沖洗2 min，進(jìn)而在0.5%鹽酸酒精中分化10～30 s，繼續(xù)流水沖洗5 min，用Masson復(fù)合染色液染色4～5 min，0.2%醋酸水溶液沖洗，5%磷鉬酸分化5～10 min，0.2%醋酸水溶液沖洗，2%苯胺藍(lán)染色液復(fù)染10～30 s，經(jīng)無水乙醇脫水后用甘油封固。顯微鏡下采集圖像，藍(lán)色代表膠原纖維，紅色代表肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞，用Image J軟件分析膠原含量。

1.3.1.4 免疫組化染色檢測各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CD68表達(dá)水平 干預(yù)16周后，采用異氟烷麻醉并處死小鼠，分離小鼠主動(dòng)脈，取出動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科，包埋后制作石蠟切片，脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后用山羊血清進(jìn)行封閉，加1∶100稀釋的一抗CD68，4 ℃孵育過夜后滴加與一抗種屬相對應(yīng)的二抗，室溫下孵育60 min；滴加新鮮配制的DAB顯色液，棕黃色區(qū)域?yàn)镃D68陽性表達(dá)；復(fù)染細(xì)胞核后用中性樹膠封固；顯微鏡下觀察到細(xì)胞核在蘇木素的染色下變成藍(lán)色。計(jì)算棕黃色區(qū)域占比，即CD68表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW 264.7巨噬細(xì)胞置于含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為消毒滅菌細(xì)胞孵箱（37 ℃，含5% CO2，濕度95%），24 h后觀察貼壁細(xì)胞情況，培養(yǎng)基渾濁后及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2.2 Western blotting法檢測巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞，將其分為空白對照組、ox-LDL組（采用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h［7］）、ox-LDL+Ad-SIRT6組（轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-SIRT6 24 h，用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h）。用PBS洗滌各組巨噬細(xì)胞并充分消化，提取蛋白后按照操作流程進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。提前按1∶100配好SIRT6、CD36、GAPDH抗體；脫脂奶粉封閉后于4 ℃冰箱中過夜進(jìn)行一抗孵育，滴加山羊抗兔IgG抗體孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測各組巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.2.3 TUNEL染色檢測巨噬細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞，將其分為空白對照組、ox-LDL組（采用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h［7］）、ox-LDL+Ad-SIRT6組（轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-SIRT6 24 h，用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h）、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組（轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-SIRT6 24 h，轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-CD36 24 h，用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h）。采用TUNEL試劑盒檢測巨噬細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。使用終濃度為100 ng/ml的DAPI染液對細(xì)胞染色10 min，流水沖去染液，加1滴熒光封片液，凋亡的巨噬細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為綠色熒光，細(xì)胞核在共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為藍(lán)色熒光。計(jì)算巨噬細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積 空白對照組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積為0。動(dòng)脈粥樣硬化組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積為（43.0±8.6）%，高于動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組的（13.2±2.6）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.489，P＜0.001），見圖1。

圖1 HE染色檢測空白對照組、動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積Figure 1 Area of atherosclerotic plaques detected by HE staining in blank control group，atherosclerosis group and atherosclerosis+SIRT6 Tg group

2.2 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量 空白對照組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量為0。動(dòng)脈粥樣硬化組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量為（7.4±1.2）%，低于動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組的（10.8±0.2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.838，P＜0.001），見圖2。

圖2 Masson染色檢測空白對照組、動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量Figure 2 Collagen content in atherosclerotic plaques detected by Masson staining in blank control group，atherosclerosis group and atherosclerosis+SIRT6 Tg group

2.3 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CD68表達(dá)水平 空白對照組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CD68表達(dá)水平為0。動(dòng)脈粥樣硬化組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CD68表達(dá)水平為（42.3±8.4）%，高于動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組的（23.8±4.5）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.139，P＜0.001），見圖3。

圖3 免疫組化染色檢測空白對照組、動(dòng)脈粥樣硬化組、動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CD68表達(dá)水平（×400）Figure 3 CD68 expression level in atherosclerotic plaques of mice detected by immunohistochemical staining in blank control group，atherosclerosis group，and atherosclerosis+SIRT6 Tg group

2.4 巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6表達(dá)水平低于空白對照組，CD36表達(dá)水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6表達(dá)水平高于ox-LDL組，CD36表達(dá)水平低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖4。

圖4 Western blotting法檢測空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of SIRT6 and CD36 in macrophages detected by Western blotting method in blank control group，ox-LDL group and ox-LDL+Ad-SIRT6 group

表1 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of SIRT6 and CD36 expression levels in macrophages in blank control group，ox-LDL group and ox-LDL+Ad-SIRT6 group

表1 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6、CD36表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of SIRT6 and CD36 expression levels in macrophages in blank control group，ox-LDL group and ox-LDL+Ad-SIRT6 group

注：ox-LDL=氧化低密度脂蛋白；a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與ox-LDL組比較，P＜0.05

組別 SIRT6 CD36空白對照組 1.000±0.018 1.000±0.023 ox-LDL組 0.464±0.042a 4.685±0.108a ox-LDL+Ad-SIRT6組 0.677±0.015ab 3.144±0.566ab F值 283.394 92.696 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 巨噬細(xì)胞凋亡率 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率分別為（10.00±2.22）%、（7 8.0 0±9.3 6）%、（2 4.0 0±4.8 0）%、（40.00±5.60）%?？瞻讓φ战M、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.340，P＜0.001）。ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為12.240、4.585、8.626，P值分別為＜0.001、0.010、＜0.001）；ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為8.892、6.034，P值均＜0.001）；ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率高于ox-LDL+Ad-SIRT6組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.757，P=0.020），見圖5。

圖5 TUNEL染色檢測空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率（×200）Figure 5 Apoptosis rate of macrophages detected by TUNEL staining in blank control group，ox-LDL group，ox-LDL+Ad-SIRT6 group and ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36 group

3 討論

不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是導(dǎo)致急性心血管事件的主要原因，而大量泡沫細(xì)胞的形成在不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病程進(jìn)展中扮演重要角色［8］。大量泡沫細(xì)胞的聚集可加劇斑塊中的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)斑塊中新生血管形成，隨著泡沫細(xì)胞的不斷聚集并且發(fā)生凋亡和壞死，斑塊中表現(xiàn)為大量脂質(zhì)池和壞死核心的形成［9］，最終導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性［10］。泡沫細(xì)胞主要是由巨噬細(xì)胞不斷攝取ox-LDL形成的，而這一重要病理過程主要受清道夫受體諸如凝集素樣ox-LDL受體1、CD36或清道夫受體A的調(diào)節(jié)［11］。在這些關(guān)鍵受體中，CD36在泡沫細(xì)胞的形成中起主要作用［12］。據(jù)報(bào)道，干預(yù)CD36的表達(dá)可抑制巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取，沉默巨噬細(xì)胞的CD36基因其對ox-LDL的結(jié)合能力明顯下降［13］。綜上，CD36在巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL進(jìn)而在泡沫細(xì)胞的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究表明，SIRT6可以通過調(diào)控炎癥、葡萄糖和脂質(zhì)代謝來參與心血管疾病和癌癥的病理進(jìn)程，其可以有效防止心肌細(xì)胞肥大，抑制心力衰竭的發(fā)生；此外，SIRT6還可以維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［14-15］。然而，SIRT6是否通過調(diào)控CD36來增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目前尚無相關(guān)研究。基于此，本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析SIRT6增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機(jī)制。

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)脈粥樣硬化組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積高于動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量低于動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CD68表達(dá)水平高于動(dòng)脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，提示過表達(dá)SIRT6能夠縮小ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的膠原含量及減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤，從而增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6表達(dá)水平低于空白對照組，CD36表達(dá)水平高于空白對照組，提示SIRT6/CD36信號通路參與了泡沫細(xì)胞形成。ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細(xì)胞中SIRT6表達(dá)水平高于ox-LDL組，CD36表達(dá)水平低于ox-LDL組；提示過表達(dá)SIRT6可下調(diào)CD36的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞形成。ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率高于空白對照組，ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率低于ox-LDL組，ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細(xì)胞凋亡率高于ox-LDL+Ad-SIRT6組，提示過表達(dá)SIRT6能夠降低巨噬細(xì)胞凋亡率，而過表達(dá)CD36可減弱SIRT6對巨噬細(xì)胞凋亡的抑制作用。由此推測，SIRT6通過下調(diào)CD36的表達(dá)水平來抑制巨噬細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，SIRT6能夠縮小ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原含量，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制巨噬細(xì)胞凋亡，從而增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，而這一作用是通過下調(diào)CD36的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。本研究為臨床通過干預(yù)SIRT6/CD36信號通路來治療不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為減少急性心血管事件的發(fā)生提供了新的治療方案。但本研究尚存在一定局限性：首先，多種機(jī)制如炎癥反應(yīng)、自噬均參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病程進(jìn)展，SIRT6通過何種機(jī)制調(diào)控CD36，進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞形成，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，目前還不得而知；此外，SIRT6/CD36信號通路是否通過調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)線粒體融合，進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)代謝，這些還有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：王婷婷、張東偉進(jìn)行研究的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、可行性分析及文章的撰寫，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；王婷婷、李妍負(fù)責(zé)文章修改；張明明負(fù)責(zé)結(jié)果分析、圖片整理；蔣國健負(fù)責(zé)文獻(xiàn)資料收集。

本文無利益沖突。