曹培東，桂 春

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)一科，廣西 南寧 530021）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis）是一種以強(qiáng)烈的免疫活性為特征的炎癥性疾病，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是臨床上最常見的治療動脈粥樣硬化性狹窄的方法。隨著對該病認(rèn)識的加深，選擇性免疫調(diào)節(jié)干預(yù)可能是抗動脈粥樣硬化治療的新方向，然而血運(yùn)重建后的免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制尚未明確。RelA 又稱NF-κB3、MGC131774 和p65，是NF-κB 家族的5 個成員之一。NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子家族作為連接免疫和炎癥的中心介質(zhì)，是先天和后天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者[1]。其中，RelA 轉(zhuǎn)錄因子對調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活化和穩(wěn)定至關(guān)重要[2]。本研究旨在驗(yàn)證PCI 對RelA 水平的影響，分析血運(yùn)重建后RelA 可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019-2021 年廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的冠狀動脈狹窄≥90%的14 例動脈粥樣硬化患者冠脈支架植入術(shù)前和術(shù)后的血清樣本，患者均無心梗、中風(fēng)、糖尿病病史。人磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子p65（pNF-KB P65）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒從上海酶聯(lián)生物科技有限公司購買。人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞（HCASMCs）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。RelA-RNAi 慢病毒及陰性對照病毒購買于上海吉凱基因。

1.2 ELISA 檢測及篩選目的基因 采用Elisa 法檢測術(shù)前和術(shù)后血清中RelA的水平，每例重復(fù)3 次。芯片數(shù)據(jù)GSE28829 來自開放數(shù)據(jù)庫GEO，包含13 個早期和16 個晚期頸動脈粥樣硬化斑塊樣本。利用GEO2R分析GSE28829，選擇校正后P＜0.05 和|logFC|≥1的基因。在開放訪問網(wǎng)站PubMed2ensembl 中輸入“血運(yùn)重建（revascularization）”“免疫調(diào)節(jié)（immunoregulation）”提取所有非重復(fù)基因。三者交集為目的基因。

1.3 功能富集分析 利用在線工具DAVID 對目的基因進(jìn)行功能富集分析，其中基因本體論（GO）對涉及生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）的基因進(jìn)行注釋[3]；京都基因和基因組百科全書（KEGG）處理基因組、生物途徑、疾病和藥物[4]。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)和分析關(guān)鍵基因（Hub gene）使用開放數(shù)據(jù)庫STRING 評估目的基因的PPI 信息，綜合得分＞0.4的被選為顯著[5]。使用軟件Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建PPI 可視化網(wǎng)絡(luò)[6]。分子復(fù)合物檢測（MCODE）用于發(fā)現(xiàn)給定網(wǎng)絡(luò)中緊密連接的節(jié)點(diǎn)，篩選并可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊基因，篩選條件為等級截止=2，k-core=2，節(jié)點(diǎn)分?jǐn)?shù)截止=0.2，最大深度=100（degree cut-off=2，k-core=2,node score cut-off=0.2，max depth=100）。PPI 中的Hub 基因通過CytosHubba 根據(jù)最大團(tuán)簇中心性（MCC）原則，選擇最短路徑中的前6 個基因并進(jìn)行功能富集分析。

1.5 TRRUST 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證 結(jié)合位點(diǎn)TRRUST v2，根據(jù)用戶輸入的功能/途徑/表型基因，查詢關(guān)鍵調(diào)控因子并進(jìn)行優(yōu)先排序[7]。

1.6 實(shí)時定量PCR 將RelA-RNAi 慢病毒和陰性對照病毒分別轉(zhuǎn)染HCASMCs，提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度。用2-△△ct法分析mRNA的相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，采用獨(dú)立樣本配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCI 手術(shù)前后RelA 水平比較 以標(biāo)準(zhǔn)品的水平為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中RelA 水平（表1、圖1）。術(shù)前RelA 水平為（13.59±2.69）μg/L，術(shù)后RelA 水平為（9.71±2.28）μg/L，支架置入前后RelA 差值為（3.88±3.68）μg/L，差值95%CI：1.75～6.01。術(shù)前RelA 水平高于術(shù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.939，P=0.002）。

圖1 RelA 水平的ROC 曲線圖

表1 血清樣本中RelA的濃度（，μg/L）

表1 血清樣本中RelA的濃度（，μg/L）

2.2 目的基因的功能富集分析 利用GEO2R 分析，獲得217 個與“動脈粥樣硬化”相關(guān)的基因。在PubMed2ensembl 中獲得了581 個與“血運(yùn)重建”相關(guān)的基因，615 個與“免疫調(diào)節(jié)”相關(guān)的基因。三者之間的10 個重疊基因?yàn)槟康幕颍▓D2）。對其功能富集分析可見，目的基因主要通過白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移途徑參與防御反應(yīng)（圖3）。

圖2 目的基因圖

圖3 目的基因的功能富集分析

2.3 Hub 基因的獲得與功能分析 基于STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖4），模塊基因（圖5），由8 個節(jié)點(diǎn)和24 條邊組成。根據(jù)MCC 方法篩選的6 個Hub 基因，包括PTPRC、ITGAM、VCAM1、MMP9、CXCR4 和SPP1，并均屬于模塊基因（圖6）。富集分析顯示，模塊基因與目的基因的作用方向一致，其中關(guān)鍵基因主要富集在白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移途徑中（表2）。

表2 模塊基因的功能富集分析（前2 名）

圖4 目的基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 模塊基因

圖6 關(guān)鍵基因

2.4 可調(diào)控關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子分析 在TRRUST數(shù)據(jù)庫中，MMP9、VCAM1、CXCR4 均受RelA的靶向調(diào)節(jié)，見表3。

表3 可調(diào)控關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子分析

2.5 RelA 調(diào)控Hub 基因的mRNA 表達(dá)分析 抑制RelA 可降低HCASMCs 中VCAM1的mRNA 表達(dá)，促進(jìn)MMP9 和CXCR4的mRNA 表達(dá)，見圖7；引物序列見表4。

圖7 實(shí)時定量PCR 檢測

表4 引物序列

3 討論

動脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)驅(qū)動的中大動脈進(jìn)行性炎癥疾病[8]。隨著人們對疾病的認(rèn)識，有證據(jù)表明[9]，動脈粥樣硬化是一種基于病變內(nèi)免疫激活和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的免疫介導(dǎo)疾病，免疫反應(yīng)參與動脈粥樣硬化的各個階段。目前，動脈粥樣硬化性疾病通常通過血管成形術(shù)和支架術(shù)來實(shí)現(xiàn)血管重建，但介入部位的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的再狹窄可能會再次降低治療效果。因此，動脈內(nèi)膜切除術(shù)和經(jīng)皮介入等血管手術(shù)后再狹窄是動脈粥樣硬化區(qū)抗炎治療的首要條件[10]。隨著免疫抑制劑對T 細(xì)胞免疫抑制作用的發(fā)現(xiàn)和對VSMCs 增殖的抑制，術(shù)后再狹窄以藥物洗脫支架的形式得以預(yù)防[11]。然而，血運(yùn)重建后的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。

RelA/p65 作為NF-κB 家族的成員之一，含量最為豐富，并具有特殊的反式激活結(jié)構(gòu)域，是炎癥反應(yīng)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活劑[12]，可調(diào)控多個下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與多種重要的細(xì)胞活動。已有研究表明[13]，lncRNA H19 可通過上調(diào)RelA 促進(jìn)動脈粥樣硬化。miR-520c-3p 通過下調(diào)RelA 來抑制PDGF-BB介導(dǎo)的增殖、遷移和G2/M 期細(xì)胞百分比的降低，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化斑塊形成[14]。此外，IL-8 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞胞外陷阱通過激活巨噬細(xì)胞中的NF-κB 信號加重動脈粥樣硬化[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCI 術(shù)后RelA 水平較術(shù)前降低（P＜0.05），這可能有利于減輕PCI 術(shù)后的炎癥反應(yīng)。

此外，本研究中生物信息學(xué)分析表明，參與血運(yùn)重建后的免疫調(diào)節(jié)基因主要與防御反應(yīng)有關(guān)，并通過白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移途徑發(fā)揮作用。白細(xì)胞通過激活的靜脈壁遷移是一種基本的免疫反應(yīng)，啟動了白細(xì)胞在靜脈壁內(nèi)和通過靜脈壁的極化運(yùn)動，受刺激的血管細(xì)胞將導(dǎo)致一過性屏障的破壞[16]。因此，白細(xì)胞不受控制的跨內(nèi)皮遷移能夠加劇動脈粥樣硬化進(jìn)展[17]。同時，本研究結(jié)果顯示，與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的VCAM1、MMP9 和CXCR4 均受RelA的直接調(diào)控，且RelA的降低抑制了HCASMCs 中VCAM1的mRNA 表達(dá)，促進(jìn)了MMP9 和CXCR4的mRNA 表達(dá)。已有研究表明[18-20]，VCAM1的表達(dá)能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重動脈粥樣硬化病變，CXCR4的表達(dá)則抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，限制動脈粥樣硬化進(jìn)展。MMP9 在動脈粥樣硬化患者中表達(dá)較高[21]，其水平升高不僅與斑塊不穩(wěn)定有關(guān)[22]，還可增加炎性細(xì)胞因子的分泌，是心臟重塑中炎癥反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。因此，PCI 術(shù)后RelA的降低主要通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移途徑參與了免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，PCI 術(shù)后RelA的降低參與了免疫調(diào)節(jié)，并主要發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用，但其上調(diào)的MMP9 與斑塊不穩(wěn)定有關(guān)，這對PCI 術(shù)后的免疫調(diào)節(jié)治療具有一定的指導(dǎo)意義。