楊偉克，劉增虎，唐芬芬，胡昌雄，董占鵬

（1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2. 紅河學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，云南 蒙自 661101）

熱激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）也叫熱休克蛋白，廣泛存在植物、動(dòng)物和微生物體內(nèi)。它是生物體在不利環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的一種特定的應(yīng)激性蛋白質(zhì)，主要參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞內(nèi)其他蛋白質(zhì)的正確折疊和維持成熟蛋白質(zhì)的生理活性[1?2]。昆蟲熱激蛋白根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸序列和生物學(xué)功能，主要分為4 個(gè)家族：小分子熱激蛋白（sHSPs）、Hsp60、Hsp70 和Hsp90[3?4]。Hsp90 是昆蟲機(jī)體內(nèi)最豐富的應(yīng)激蛋白之一，通過(guò)調(diào)控和維持細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的構(gòu)象及功能，使細(xì)胞在逆境脅迫下正常存活[5?6]。溫度是影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一，昆蟲具有在非正常溫度環(huán)境生存的能力，這是機(jī)體熱激反應(yīng)產(chǎn)生脅迫抗性的結(jié)果。Hsp90基因在昆蟲體內(nèi)會(huì)隨著溫度的改變而發(fā)生改變，它通過(guò)調(diào)控自身表達(dá)量增強(qiáng)機(jī)體對(duì)冷熱脅迫的耐受性[7]。另外，Hsp90對(duì)維持昆蟲正常生理代謝及生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。果蠅和赤擬谷盜Hsp83均屬于Hsp90 蛋白家族成員，果蠅Hsp83基因?qū)φ＞蛹?xì)胞的形成、存活和生長(zhǎng)發(fā)育以及中心體正常發(fā)揮功能是必需的[8]。赤擬谷盜Hsp83基因在成蟲卵巢發(fā)育過(guò)程起著重要的保護(hù)作用，通過(guò)RNAi 技術(shù)抑制赤擬谷盜Hsp83基因的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致雌蟲無(wú)法產(chǎn)出成熟的卵細(xì)胞[9]。

琥珀蠶（Antheraea assamensis）是一種野生絹絲昆蟲，主要分布在印度東北部和印緬邊境地區(qū)[10]。因其繭絲堅(jiān)韌、耐磨、呈天然琥珀色且不易褪色，具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。在國(guó)內(nèi)，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所率先開(kāi)展了野生琥珀蠶資源的調(diào)查搜集工作，并對(duì)其生物學(xué)特征進(jìn)行了研究[11]。與家蠶相比，琥珀蠶具有典型的野蠶特性，能夠更好適應(yīng)野外惡劣的環(huán)境，然而其抗逆機(jī)制尚不清楚。Hsp90 作為昆蟲機(jī)體一類重要的抗逆蛋白，在昆蟲遭受各種不良脅迫、適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中扮演了重要角色。目前，關(guān)于Hsp90 在琥珀蠶幼蟲應(yīng)對(duì)溫度和饑餓脅迫過(guò)程中的生理作用及分子機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，探究琥珀蠶幼蟲在遭受高溫、低溫和饑餓脅迫后熱激蛋白AaHsp90基因的變化規(guī)律，不僅有助于深入了解琥珀蠶對(duì)外界惡劣環(huán)境的適應(yīng)進(jìn)化機(jī)制，還可為琥珀蠶的抗逆性研究和品種選育等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

琥珀蠶來(lái)自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶遺傳育種與應(yīng)用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，幼蟲在室內(nèi)以新鮮天竺桂枝葉飼養(yǎng)至5齡第3天。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、低溫冷藏柜和小型高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、Bio-rad 普通PCR擴(kuò)增儀和雙光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自廣州深華生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自昆明伯騰儀器有限公司。

1.2.2 主要試劑 高純總RNA 快速提取試劑盒（貨號(hào)RP1202）購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PCR 擴(kuò)增Mix（貨號(hào)TSE101）購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑（貨號(hào)RR047A）和熒光定量PCR 試劑TB Green?Premix ExTaq?（貨號(hào)RR42LR）均購(gòu)自TakaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 溫度脅迫處理 選擇體型大小相近的5 齡第3 天琥珀蠶幼蟲，分別置于4 ℃低溫和38 ℃高溫條件下，并連續(xù)沖擊1 h、3 h、6 h 和9 h，冰上解剖琥珀蠶幼蟲，取血淋巴、脂肪體和中腸，對(duì)照組（26 ℃正常飼養(yǎng)）同時(shí)取材。每次取材均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取3頭蠶，樣品用液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?.3.2 饑餓脅迫處理 從5 齡第3 天上午9 點(diǎn)開(kāi)始停止喂食，在饑餓處理6 h、12 h、18 h 和24 h 后取材，取材方式同溫度脅迫處理組。

1.3.3 總RNA 的提取和cDNA 的制備 根據(jù)高純總RNA 快速提取試劑盒操作說(shuō)明，提取琥珀蠶不同組織的總RNA。雙光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，按照TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作制備cDNA，用于常規(guī)PCR 擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3.4 基因引物的設(shè)計(jì)和合成 以陳安利等[12]報(bào)道的琥珀蠶β-肌動(dòng)蛋白基因（β-actin）（GenBank 登錄號(hào)：KY676861）為內(nèi)參基因，熱激蛋白基因AaHsp90（GenBank 登錄號(hào)：MK165664.1）為靶標(biāo)基因。利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)定量引物，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成（序列見(jiàn)表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

1.3.5 靶標(biāo)基因引物的PCR 檢測(cè) 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃15 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 按照TB Green?Premix ExTaq?說(shuō)明書配制熒光定量PCR 反應(yīng)體系，根據(jù)Bio-Rad 公司CFX-96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作說(shuō)明設(shè)定運(yùn)行程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40 次。采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。利用Excel 2016和SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 琥珀蠶AaHsp90基因引物檢測(cè)

以對(duì)照組琥珀蠶不同組織總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，其目的主要是明確AaHsp90基因定量引物的特異性以及是否有明顯的引物二聚體產(chǎn)生。圖1 結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的AaHsp90基因定量引物能從cDNA 模板中擴(kuò)增出目的條帶，并且沒(méi)有明顯的引物二聚體條帶出現(xiàn)。說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物符合熒光定量PCR 檢測(cè)的要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 AaHsp90基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of AaHsp90

2.2 高溫脅迫對(duì)琥珀蠶AaHsp90基因表達(dá)的影響

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)高溫、低溫和饑餓處理不同時(shí)間后琥珀蠶幼蟲各組織AaHsp90基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。將對(duì)照組AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，不同脅迫處理組AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量若明顯大于1，表明基因上調(diào)表達(dá)；若相對(duì)表達(dá)量的值明顯小于1，說(shuō)明該基因的表達(dá)受到抑制。

用38 ℃高溫處理琥珀蠶5 齡第3 天幼蟲，其中腸、脂肪體和血淋巴熱激蛋白AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量變化情況如圖2 所示。高溫處理1 h 和3 h，琥珀蠶中腸AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)差異；高溫處理6 h，AaHsp90基因的表達(dá)明顯上調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1.71 倍；而高溫處理9 h，AaHsp90基因的表達(dá)被抑制，相對(duì)表達(dá)量降至對(duì)照組的36%。高溫處理3 h 和6 h，脂肪體AaHsp90基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.92 倍和3.16 倍；高溫處理9 h，脂肪體AaHsp90基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，表達(dá)量降至對(duì)照組的27%。血淋巴AaHsp90基因在高溫處理1 h就開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，處理3 h 時(shí)，相對(duì)表達(dá)量最高，是對(duì)照組的4.75 倍；處理6 h 時(shí)，AaHsp90基因相對(duì)表達(dá)量有減弱的趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1.58倍；處理9 h 時(shí)，AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量降至最低，僅為對(duì)照組的21%。

圖2 不同時(shí)長(zhǎng)38 ℃高溫處理琥珀蠶不同組織AaHsp90基因的表達(dá)量變化Fig.2 Changes of AaHsp90 expression in different tissues of Antheraea assama after treatment under 38 ℃for diffferent time

2.3 低溫脅迫對(duì)琥珀蠶AaHsp90基因表達(dá)的影響

圖3 結(jié)果顯示，用4 ℃低溫處理琥珀蠶幼蟲1 h，中腸AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量略低于對(duì)照組；處理3 h 和6 h，AaHsp90基因的表達(dá)受到明顯抑制，其相對(duì)表達(dá)量分別降低至對(duì)照組的38%和32%，9 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量降至最低，為對(duì)照組的12%。低溫處理1 h 和3 h，脂肪體AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異；處理6 h 和9 h，AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量分別降低至對(duì)照組的21%和13%，基因的表達(dá)明顯受到抑制。血淋巴AaHsp90基因在低溫處理1 h 就開(kāi)始下調(diào)表達(dá)，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，持續(xù)下調(diào)表達(dá)；在低溫處理9 h 時(shí)，相對(duì)表達(dá)量極低，僅為對(duì)照組的9.26%。

圖3 不同時(shí)長(zhǎng)4 ℃低溫處理琥珀蠶不同組織AaHsp90基因的表達(dá)量變化Fig.3 Changes of AaHsp90 expression in different tissues of Antheraea assama after treatment under 4 ℃for diffferent time

2.4 饑餓脅迫對(duì)琥珀蠶AaHsp90基因表達(dá)的影響

由圖4 可知，饑餓處理12 h 和18 h 均能明顯誘導(dǎo)琥珀蠶幼蟲中腸AaHsp90基因的表達(dá)，其中饑餓12 h，AaHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量最高，是對(duì)照組的3.43 倍；而饑餓24 h，中腸AaHsp90基因的表達(dá)受到明顯抑制，其相對(duì)表達(dá)量降至對(duì)照組的12%。饑餓6 h 對(duì)脂肪體和血淋巴AaHsp90基因的表達(dá)均沒(méi)有影響。饑餓12 h 和18 h，脂肪體AaHsp90基因的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.91 倍和2.27 倍；饑餓24 h 對(duì)脂肪體AaHsp90基因的表達(dá)有明顯抑制作用，其相對(duì)表達(dá)量降低至對(duì)照組的15%。血淋巴AaHsp90基因僅在饑餓12 h和18 h 出現(xiàn)微弱的上調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.46 倍和1.37 倍，饑餓24 h 嚴(yán)重抑制AaHsp90基因的表達(dá)。

圖4 不同時(shí)長(zhǎng)饑餓處理琥珀蠶不同組織AaHsp90基因的表達(dá)量變化Fig.4 Changes of AaHsp90 expression in different tissues of Antheraea assama after starvation for diffferent time

3 結(jié)論與討論

昆蟲在多變的自然環(huán)境中生存，會(huì)遭受多種外界環(huán)境的脅迫，比如饑餓的威脅、溫度和濕度的驟變等。昆蟲機(jī)體通過(guò)調(diào)控Hsp90基因的表達(dá)應(yīng)對(duì)不良脅迫是其適應(yīng)環(huán)境的一項(xiàng)重要策略[2?3]。目前，許多昆蟲的Hsp90基因被克隆鑒定，Hsp90基因能通過(guò)增強(qiáng)自身的表達(dá)量，抵御和應(yīng)對(duì)不良脅迫[14?18]。在高溫36 ℃和低溫4 ℃脅迫下，草地貪夜蛾雌雄成蟲SfHsp90基因的表達(dá)量顯著提高，表明Hsp90基因在響應(yīng)環(huán)境溫度脅迫，幫助昆蟲適應(yīng)外界條件變化過(guò)程中發(fā)揮了重要功能[14]。昆蟲體內(nèi)Hsp90基因的增量表達(dá)有助于其對(duì)溫度的耐受性，用高溫38 ℃和40 ℃脅迫處理瓜實(shí)蠅成蟲1 h 和2 h 后，其體內(nèi)BcHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組[15]。梨小食心蟲Hsp90基因的相對(duì)表達(dá)量在高溫脅迫下隨溫度的升高而顯著增高，且與溫度脅迫程度呈正相關(guān)[16]。用40 ℃處理黏蟲6 h，MsHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量最高，說(shuō)明MsHsp90基因在黏蟲體內(nèi)可以提高機(jī)體的耐熱性[17]。柞蠶5齡幼蟲經(jīng)42 ℃高溫處理30 min，血淋巴、中腸和脂肪體ApHsp90基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，表明ApHSP90基因在柞蠶抗高溫中起到了一定的保護(hù)作用[18]。

琥珀蠶5 齡幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的最適宜溫度是26～32 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制其正常的生理代謝進(jìn)程，造成幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至造成死亡[19]。本研究中，用38 ℃高溫處理5齡第3天琥珀蠶幼蟲，中腸、脂肪體和血淋AaHsp90基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先明顯增加后急劇減弱的趨勢(shì)。琥珀蠶幼蟲血淋巴、脂肪體和中腸的AaHsp90基因分別在高溫刺激1 h、3 h 和6 h 出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明不同組織AaHsp90基因?qū)Ω邷卮碳ろ憫?yīng)的時(shí)間并不一致，而高溫處理9 h，各組織AaHsp90基因的表達(dá)明顯受到抑制。這表明短時(shí)間的高溫刺激，能有效誘導(dǎo)AaHsp90基因的表達(dá)，提高琥珀蠶幼蟲應(yīng)對(duì)高溫的耐熱能力；而隨著高溫刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，AsHsp90基因的相對(duì)表達(dá)量急劇降低，琥珀蠶機(jī)體抵御高溫的能力開(kāi)始下降。4 ℃低溫處理1 h，琥珀蠶中腸和血淋巴AaHsp90基因就出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，并且其相對(duì)表達(dá)量隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。低溫處理1 h和3 h，脂肪體AaHsp90基因的表達(dá)量無(wú)明顯變化，當(dāng)?shù)蜏卮碳r(shí)間增加到6 h 和9 h，AaHsp90基因的表達(dá)受到明顯抑制，說(shuō)明脂肪體AaHsp90基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)晚于血淋巴和中腸。低溫處理對(duì)琥珀蠶各組織AaHsp90基因表達(dá)有一定的抑制作用，表明琥珀蠶幼蟲對(duì)低溫的耐受性較弱。琥珀蠶主要分布在熱帶或亞熱帶地區(qū)，耐高溫不耐低溫是其長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。

琥珀蠶未被完全馴化，具有典型的野蠶特性，在野外難免會(huì)遭遇一定程度的食物短缺，為了適應(yīng)野外不斷變化的環(huán)境，其自身耐受饑餓脅迫的能力也會(huì)有所提高。本研究結(jié)果顯示，饑餓脅迫后，琥珀蠶中腸、脂肪體和血淋巴AaHsp90基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后急劇減弱的趨勢(shì)。饑餓脅迫12 h 和18 h，琥珀蠶中腸、脂肪體和血淋巴AaHsp90基因的表達(dá)量均升高，其中饑餓12 h 各組織AaHsp90基因的表達(dá)量均最高，說(shuō)明AaHsp90基因在琥珀蠶抵御饑餓脅迫時(shí)發(fā)揮了重要作用。但是饑餓24 h，各組織AaHsp90基因的表達(dá)量明顯降低，表明琥珀蠶對(duì)饑餓的耐受是有限的。饑餓24 h 會(huì)導(dǎo)致琥珀蠶機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝水平減弱，在一定程度上抑制了AsHsp90基因的表達(dá)。

綜上，琥珀蠶5 齡幼蟲在遭受38 ℃高溫或饑餓脅迫后，機(jī)體Aahsp90基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后急劇減弱的趨勢(shì)，而4 ℃低溫脅迫抑制Aahsp90基因的表達(dá)，這表明AaHsp90 蛋白在琥珀蠶幼蟲抵御高溫和饑餓脅迫的過(guò)程中發(fā)揮了一定的功能。