張 靜，粟建光，唐 蜻，戴志剛，陳小軍，許 英

（中國農(nóng)業(yè)科學院 麻類研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部麻類生物學與加工重點實驗室，湖南 長沙 410205）

大麻（Cannabis sativaL.）為大麻科大麻屬1 年生草本植物，是重要的藥用和纖維作物，也是現(xiàn)存最古老的作物之一[1]。傳統(tǒng)上，大麻的主要功能是提取韌皮纖維作為紡織原料以及種子榨油食用。近年來，對大麻活性成分的大量研究表明，大麻中含有多種生物活性物質(zhì)，部分生物活性物質(zhì)具有較高藥用價值，如大麻素[2]。目前，研究最多的大麻素為四氫大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD），二者均屬于萜類化合物，且互為同分異構(gòu)體[3]，是大麻中含量較高、藥用性能研究較成熟的活性物質(zhì)。THC 有較強的致幻作用和成癮性，過量攝入會對神經(jīng)系統(tǒng)和身體造成損傷[4]，因此大麻栽培和利用等環(huán)節(jié)均受到嚴格管控，適合大面積種植的工業(yè)大麻品種要求THC 含量低于0.3%[5]。CBD 是非成癮性大麻素，已有研究證實，CBD 能夠阻斷某些多酚對人體神經(jīng)系統(tǒng)的影響，對癲癇、癌癥、抑郁癥等精神性疾病具有很好的藥效[6]。工業(yè)大麻中CBD 藥用性能的開發(fā)，豐富了醫(yī)學原料，同時對工業(yè)大麻育種提出了新的要求，選育高CBD低THC含量的工業(yè)大麻品種成為大麻育種的首要目標[7]。

腺毛主要參與植物的防御反應、合成并儲存某些次生代謝物[8]。按有無分泌功能可將腺毛分為分泌型腺毛和非分泌型腺毛，大麻、黃花蒿、煙草和部分茄科植物等均有分泌型和非分泌型腺毛的相關(guān)研究報道。非分泌型腺毛是進行植物分類的一項重要依據(jù)，也是植物抵御某些非生物脅迫和生物脅迫的有力屏障[9?11]；分泌型腺毛被譽為“植物化工廠”，主要分泌和儲存某些次生代謝物，其分泌物主要包括部分香料作物的香氣物質(zhì)和某些特定的酚類、醛類等物質(zhì)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，大麻素類物質(zhì)一般是在腺毛中合成與積累[13]，大麻素含量與分泌型腺毛相關(guān)。

工業(yè)大麻腺毛單位面積數(shù)量一般表現(xiàn)為雌株比雄株豐富，雌株中又以種子苞片、花、幼葉等部位腺毛最密集。腺毛分泌物與大麻的藥用價值密切相關(guān)，大麻腺毛的種類及密度對大麻素含量具有較大影響[13]。目前，國內(nèi)高CBD 含量工業(yè)大麻品種資源匱乏，為推動藥用工業(yè)大麻定向選育，培育出高藥用價值工業(yè)大麻品種，系統(tǒng)闡述了工業(yè)大麻腺毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及3 種分泌型腺毛的特征及特性、腺毛內(nèi)主要次生代謝物質(zhì)合成途徑、大麻素調(diào)控機制。

1 大麻腺毛的形態(tài)與功能

大麻腺毛觀察早在20世紀已經(jīng)開展，不同腺毛的形狀、大小差別較大且組成細胞數(shù)量不同[14]，有分泌型腺毛和非分泌型腺毛之分，大麻雌雄植株均分布有分泌型腺毛和非分泌型腺毛，其中雄性植株分泌型腺毛的數(shù)量和種類均明顯少于雌性[15]。筆者通過Leica 立體顯微鏡觀察大麻雌株葉片和雌花發(fā)現(xiàn)，雌株葉片及雌花表面腺毛分布較為密集，在顯微鏡下觀察到的腺毛大部分呈透明狀，由球形的頭部和長柄組成（圖1），同時也嘗試用掃描電鏡觀察生長中期的大麻葉表皮，發(fā)現(xiàn)大麻葉片表皮腺毛中非分泌型腺毛分布最為廣泛，且密度最高（圖2），推斷葉片表面密布的非分泌型腺毛可能與植物的自我防御有關(guān)。

圖1 雌性工業(yè)大麻葉片（A）和雌花（B）表面腺毛觀察Fig.1 Glandular hairs on female industrial hemp leaves（A）and female flowers（B）

圖2 大麻葉表皮掃描電鏡觀察Fig.2 Top view of hemp leaf epidermis by scanning electron microscope

20 世紀70 年代，研究人員通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大麻嫩葉和花萼表面存在3 種不同類型的分泌型腺毛，分別為頭狀有柄腺毛（Capitate?stalked glandular trichome）、頭狀無柄腺毛（Capitate?sessile glandular trichome）和球狀腺毛（Bulbous glandular trichome）[3，14]（圖3），且3 種分泌腺毛的分泌細胞數(shù)量不相同[14，16]，但均有用于儲存和分泌代謝物的分泌腔。

研究者[15]通過觀察大麻花萼發(fā)育進程發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期分泌型腺毛的種類和密度不同，推測此現(xiàn)象可能與植株所處的生長時期有關(guān)，其中，有柄腺毛通過一個由多細胞組成的長柄將球形的分泌腔與植物表面連接（圖3A）；球狀腺毛由球狀的頭部和短柄狀的基座組成（圖3C）[14]，且已有研究結(jié)果顯示，球狀腺毛只能生產(chǎn)有限的特定代謝產(chǎn)物；無柄腺毛是由一個直徑50～70 μm 的球形分泌腔直接著生在大麻組織表面[14?15]（圖3B）。研究表明，有柄腺毛的分泌能力最強，分泌的大麻素種類最多[13，17]，熒光染色試驗[14]同樣證實，有柄腺毛能合成的大麻素種類最多，分泌能力較無柄腺毛更強，可能與有柄腺毛和無柄腺毛頭部大小差異有關(guān)[13]。研究者在觀察大麻苞片表面腺毛發(fā)育進程時發(fā)現(xiàn)，有柄腺毛較無柄腺毛和球狀腺毛出現(xiàn)時期滯后，且隨著植株發(fā)育進程不斷推進，有柄腺毛占總腺毛比例不斷上升[15]。LIVINGSTON 等[14]推測，無柄腺毛可能是有柄腺毛發(fā)育的早期階段，有柄腺毛可能由無柄腺毛進化形成。

圖3 大麻嫩葉和花萼表面3種分泌型腺毛Fig.3 Three types of hemp glandular trichomes on tender leaves and calyces

2 腺毛內(nèi)主要次生代謝物質(zhì)的合成途徑

植物次生代謝物質(zhì)是指通過植物次生代謝途徑合成的一類生物小分子[18]，是植物適應環(huán)境和應對不良環(huán)境的重要防護屏障，植物次生代謝物主要包括黃酮類、萜類等。腺毛是植物重要的分泌器官，大量次生代謝物的合成以及儲存在此進行，大麻素是大麻腺毛的主要次生代謝物，研究報道，大麻素主要由大麻分泌型腺毛合成和儲存，大麻素的合成過程較為復雜，包括己酸途徑、2-甲基赤蘚醇磷酸（MEP）途徑、焦磷酸香葉酯（GPP）途徑和以這3個途經(jīng)合成產(chǎn)物為底物的Cannabinoid 途徑4 個環(huán)節(jié)共同完成[19?22]（圖4）。其中，MEP途徑為大麻素與青蒿素合成中共有的環(huán)節(jié)，也是植物進行萜類物質(zhì)合成的重要步驟[23]，通過MEP 途徑合成的異戊烯基二磷酸（IPP）和二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）同為大麻素和青蒿素合成的重要底物之一。大麻素合成過程中，己酸途徑產(chǎn)物乙酰輔酶A 通過聚酮合酶（OLS）催化形成戊基二羥基苯酸（OLA），與GPP 途徑產(chǎn)生的GPP 在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化下形成產(chǎn)物大麻萜酚酸（CBGA）[20，24]，這一步驟被認為是大麻素合成途徑中最為關(guān)鍵的一步，通過此次催化反應生成大麻素合成途徑中的第一類大麻素[25]，也為后續(xù)多種大麻素的合成提供底物。此外，大麻素合成過程中OLA 也可以和GPP 的異構(gòu)體焦磷酸橙花酯（NPP）同樣通過異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化生成大麻酚酸（CBNRA）[26?27]，但由于CBNRA 合成量較少，此路徑研究報道較少。CBGA 經(jīng)腺毛中特異性表達的四氫大麻酚酸合成酶（THCAS）、大麻二酚酸合成酶（CBDAS）、大麻環(huán)萜酚酸合成酶（CBCAS）催化形成四氫大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）、大麻環(huán)萜酚酸（CBCA）[28?29]，最后經(jīng)過非酶促反應脫羧形成THC、CBD和大麻環(huán)萜酚（CBC）[30]。

圖4 大麻素合成途徑Fig.4 The synthesis pathway of cannabinoid

3 大麻素調(diào)控機制

大麻素是大麻腺毛合成的重要藥用活性物質(zhì)，目前關(guān)于大麻素的研究熱點主要集中在降低精神活性物質(zhì)THC 含量及提高藥用價值成分CBD 含量方面[7]。CBDA 和THCA 是由共同的前體物質(zhì)CBGA轉(zhuǎn)化而來，且互為同分異構(gòu)體，調(diào)控機制較為復雜[31]，易受環(huán)境和品種本身因素影響。大麻中CBD和THC 含量波動較大，但CBD 與THC 比值在作物的生命周期中變化較小，推測CBD/THC 易受位于同一個基因座上的2 個共顯性基因影響，當BT基因純合時以THC的合成為主，當BD基因純合時則主要合成CBD，BD和BT同時出現(xiàn)則THC和CBD均合成[32]。

陳璇等[20]篩選了16 個與大麻素合成相關(guān)的基因，通過熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)，4-磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖激酶（CMK）基因、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶（MDS）基因、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶（HDS）基因、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HDR）基因、GPP基因的表達量與大麻素合成量呈正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，在以大麻萜酚酸為底物的下游生物合成過程中，單一CBDAS 可以催化CBGA 合成CBDA 和少量THCA，同樣，單一THCAS 也可以催化合成少量CBDA[20，33]。

THCAS 與CBDAS 基 因 位 于6 號 染 色 體[33]，CBDAS/THCAS 相關(guān)的13 個基因拷貝主要分布在9號 染 色 體25～33 Mb 的3 段 區(qū) 間 內(nèi)，1 個 單 拷 貝CBDAS 相關(guān)基因位于30 Mb 區(qū)間，其余基因分別位于25 Mb和29 Mb 2個串聯(lián)重復簇內(nèi)，每個重復單元由基因序列和兩側(cè)的LTR 序列構(gòu)成[5]。目前，THCAS 基因是大麻素調(diào)控基因中功能研究最深入的基因。1995年，TAURA等[34]發(fā)現(xiàn)，THCAS是74 ku的單體脫氫酶，催化由戊基間苯二酚酸到THCA 的氧化環(huán)化反應。2004 年，科學家成功克隆THCAS基因，進一步證明THCAS 基因的功能是調(diào)控CBGA轉(zhuǎn)換為THCA[35]。研究發(fā)現(xiàn)，高THC 含量大麻中THCAS基因表達量量高[36]，而CBDAS基因在工業(yè)大麻中表達量呈偏高[37]。不同pH 值同樣影響著THCAS及CBDAS 的催化活性，當pH 值為4.5 時，CBDAS 催化能力最強，分泌CBD 含量相對較高[33]。THCA 和CBDA 的合成是由2 個堿基序列相似度較高且聯(lián)系較為密切的不同基因控制[38?39]，且THC 和CBD 在不同類型大麻中以相似的路徑合成[40]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，在2011年第1 個大麻品種Purple Kush 參考基因組序列發(fā)布后，研究人員發(fā)現(xiàn)，該品種的基因序列中存在1個THCAS基因和多個CBDAS基因，由此推測CBD 合成由多位點控制[41]，然而，其多個CBDAS 基因能否行使功能尚未完全驗證。進一步研究大麻品種Finola 基因組和轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，CBDAS基 因 也 能 合 成THC[39，41]。THCAS 和CBDAS 同 為 大麻素合成途徑末端最重要的2 種酶，這2 種酶的催化作用顯著影響大麻重要藥用成分和毒性物質(zhì)含量，調(diào)整THCAS 基因的表達能夠有效抑制THC 的合成，通過RNA 干擾THCAS 基因是降低THC 合成量的一個有效途徑[42]。

4 討論及展望

非分泌型腺毛是植物抵御某些非生物脅迫和生物脅迫的有力屏障，分泌型腺毛是分泌和儲存某些次生代謝物的植物化工廠。據(jù)報道，植物腺毛生長除受自身因素影響外，還受光、水、肥、激素等環(huán)境因素影響。不同的光照強度可以改變煙葉表面腺毛的類型、密度以及內(nèi)容物含量，影響煙葉的化學品質(zhì)[43]，也可影響薄荷次生代謝物的分泌[44]；藍光可誘導茶樹合成更多次生代謝類物質(zhì)[45]。干旱脅迫可改變荊芥表面腺毛數(shù)量及分泌的次生代謝物的種類和比例[46]，顯著影響煙草香氣物質(zhì)西柏烷類化合物含量[47]。缺少Fe、B、Ca、Mg 等元素都會對煙草腺毛的生長不利[48]，而增施腐植酸類有機肥料能夠顯著提高煙草腺毛密度，提升煙草香氣物質(zhì)合成量[49]。植物激素茉莉酸甲酯能使番茄[50]、向日葵[51]和黃花蒿[52?53]腺毛數(shù)目增加，次生代謝物質(zhì)和防御蛋白含量上升；噴施水楊酸能夠緩解非生物脅迫對青蒿的影響，同時刺激其腺毛發(fā)育，提高青蒿素的合成量[54]；噴施赤霉素使煙草葉片表面腺毛密度增加近1/3，進而增加腺毛分泌物含量，提升烤煙香氣[55]，也能促進番茄表面腺毛生長[56]。有關(guān)工業(yè)大麻腺毛生長影響因子的報道較少，除吳姍[57]報道激動素（KT）影響其代謝物質(zhì)分泌外，光、水、肥及其他激素對腺毛生長的影響鮮有研究報道，因此，今后工業(yè)大麻研究可側(cè)重于深入研究光、水、肥、激素等非生物因素對工業(yè)大麻腺毛分泌能力的影響。

大麻腺毛的觀察研究歷時近50 a，其功能和結(jié)構(gòu)已得到清晰展示，其分泌的重要次生代謝物質(zhì)CBD 及THC 的合成途徑和調(diào)控機制研究也已有頗多報道。但是，大麻腺毛分泌的代謝物質(zhì)除CBD 及THC 外還有很多其他物質(zhì)，其中，酚類物質(zhì)就有60多種，如大麻酚（CBN）、次大麻二酚（CBDV）及CBC等，這些物質(zhì)大部分具有特殊藥用功效[58]，然而，這些酚類物質(zhì)在腺毛中分泌、合成及調(diào)控的途徑研究少見報道，故更多的大麻腺毛分泌次生代謝產(chǎn)物功能及其調(diào)控機制尚待挖掘，以有助于工業(yè)大麻藥用物質(zhì)的開發(fā)與利用。

大麻腺毛中分泌代謝物質(zhì)THC 具較強的致幻作用和成癮性，致使大麻種植一直受限。分子設(shè)計育種和分子聚合輔助育種是遺傳改良的有效途徑，也是未來的育種方向。若能采用敲除或者沉默等方法消除與THC 分泌相關(guān)聯(lián)基因的影響，或者通過分子設(shè)計育種和分子聚合輔助育種選育出零THC含量的工業(yè)大麻品種，將促進工業(yè)大麻各領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。然而，目前與工業(yè)大麻腺毛生長發(fā)育及次生代謝分泌調(diào)控關(guān)聯(lián)基因的報道較少，研究深度較淺，加上工業(yè)大麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不成熟，關(guān)聯(lián)基因功能尚未得到充分驗證。因此，有必要加大與腺毛分泌代謝物質(zhì)關(guān)聯(lián)基因尤其是與THC 關(guān)聯(lián)關(guān)鍵基因的挖掘研究，優(yōu)異等位基因的挖掘及功能驗證將為大麻腺毛分泌特性改良、藥用工業(yè)大麻定向選育、低毒甚至無毒高藥用價值工業(yè)大麻品種培育奠定基礎(chǔ)。