姚文艷，姜 暉

（東南大學 生物科學與醫(yī)學工程學院，江蘇 南京 210096）

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性條件致病菌，主要存在于海水及海底沉積物中［1］。該菌的多個組成成分（如莢膜多糖、Ⅳ型菌毛、溶血素和細胞外金屬蛋白酶等）作為毒力因子起著重要的致病作用［2－4］。創(chuàng)傷弧菌通過傷口或腸道感染傳播，可導致多種水產養(yǎng)殖動物和人體患病，引發(fā)人體腸胃炎、腦膜炎、原發(fā)性敗血癥、傷口組織壞死等疾?。?－6］。在所有食源性病原體中，創(chuàng)傷弧菌的病死率最高，且發(fā)病迅速，傷口感染的平均潛伏期僅為16 h，敗血癥的平均潛伏期為26 h［7］。美國疾病控制和預防中心在1964年首次分離出創(chuàng)傷弧菌［8］。據(jù)統(tǒng)計，美國超過95%的海產品相關死亡案例由創(chuàng)傷弧菌感染引起［9］；我國臺灣也報道了多起創(chuàng)傷弧菌感染死亡病例［10］；歐盟于2003年要求從我國進口的魚蝦等海產品必須進行創(chuàng)傷弧菌檢測。因此，有效的檢測技術在創(chuàng)傷弧菌感染臨床檢驗及食品安全保障方面非常重要。本文將介紹創(chuàng)傷弧菌的傳統(tǒng)與現(xiàn)代檢測技術，為創(chuàng)傷弧菌的有效防控及患者的診斷治療提供科學依據(jù)。

1 傳統(tǒng)病原學檢測技術

基于常規(guī)病原學診斷方法，食品和藥物管理局細菌分析手冊（FDA－BAM）標準法中詳細規(guī)定了食品中創(chuàng)傷弧菌的檢驗程序?；静襟E包括樣本的制備、選擇性富集培養(yǎng)、選擇性分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、細菌形態(tài)觀察、生化檢測等，其中選擇性培養(yǎng)基的分離鑒定是關鍵環(huán)節(jié)。目前，常用的創(chuàng)傷弧菌培養(yǎng)法主要有基于選擇性培養(yǎng)基的直接培養(yǎng)法、增菌培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)法，此3種培養(yǎng)方法的比較如表1所示。適用于創(chuàng)傷弧菌的選擇性培養(yǎng)基有許多種，主要包括VVMc培養(yǎng)基和mCPC瓊脂培養(yǎng)基等［11］?；谶x擇性培養(yǎng)基的直接培養(yǎng)法檢測結果陽性率低，對目標菌株的最低檢出量相對較高。當采集樣本中含有雜菌時，雜菌可進一步抑制創(chuàng)傷弧菌的增長，較難培養(yǎng)獲取純菌株，使目標菌株的菌落數(shù)量低于最低檢出量，從而造成漏檢。增菌培養(yǎng)法可有效提高目標菌株檢測的靈敏度。我國首個創(chuàng)傷弧菌食品安全國家標準（GB 4789.44－2020）《食品微生物學檢驗創(chuàng)傷弧菌檢驗》即是將增菌培養(yǎng)法和聚合酶鏈式反應（PCR）檢測相結合，用于水產品中的創(chuàng)傷弧菌檢測，有效提高了檢測效率［12］。且加入適當?shù)目股乜捎行б种拼蟛糠指锾m氏陽性細菌，提高增菌效果［13］。此外，顯色培養(yǎng)法可根據(jù)菌落顏色直接鑒定菌種，避免了對菌落大小形態(tài)類似的菌株做進一步分離培養(yǎng)鑒定的復雜操作程序，極大提升了目標菌株的檢測效率［14］。

表1 創(chuàng)傷弧菌3種培養(yǎng)方法的比較Table 1 Comparison of three culture methods of V.vulnif icus

2 免疫學檢測技術

免疫學檢測方法基于抗原抗體的特異性反應實現(xiàn)對目標菌株的識別響應。目前，細菌抗體的抗原靶點包括細菌表面的脂多糖（LPS）、莢膜多糖以及外毒素等。由于以整個目標菌體作為檢測對象，其準確性取決于抗原抗體的特異性結合能力。反應過程中的非特異性吸附會帶來假陽性結果。相比于病原學檢測方法，免疫學方法可將檢測時間縮短至數(shù)小時，操作更加簡便，尤其是與層析技術相結合可通過肉眼直接觀察病原菌的檢測結果，無需專門的分析設備，實用性強而被廣泛應用。但免疫學方法仍需在實驗室內進行目標菌株的增殖培養(yǎng)，無法實現(xiàn)食品樣本的現(xiàn)場檢測；其抗體難獲取，易失活，且存在較明顯的非特異性反應，目前該方法還在進一步的改進研究中。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）將酶催化下的底物顯色反應與酶標記的抗原抗體反應相結合，從而實現(xiàn)目標物的特異性靈敏檢測，主要包括直接ELISA、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA及競爭ELISA等。ELISA技術對創(chuàng)傷弧菌的檢測應用由來已久，早在1997年Biosca等［15］便開發(fā)了一種基于兔體內抗LPS的多克隆抗體的間接ELISA檢測方法，成功用于鰻鱺魚感染的創(chuàng)傷弧菌生物型2的檢測，檢出限為104個細胞/孔～105個細胞/孔，并用于檢測非可培養(yǎng)狀態(tài)的細胞。張家敏等［16］成功制備出創(chuàng)傷弧菌溶細胞素鼠源性單克隆抗體，可用于檢測自然表達的創(chuàng)傷弧菌溶細胞素。劉秀萍等［17］開發(fā)了一種雙抗體夾心ELISA法，用于食物樣品中擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌毒素的快速、同時、靈敏檢測。古小莉等［18］建立了一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測的斑點ELISA技術，可直接肉眼判定檢測結果，方便經濟，便于在基層實驗室推廣應用。

2.2 免疫層析法

免疫層析法（IC）是在硝酸纖維素膜上固定特異性抗體，將待測樣品浸入到該膜的一端，之后樣品會在毛細管的作用下沿著硝酸纖維素膜向前移動，當移動到有抗體存在的區(qū)域時，抗體會特異性結合樣品中對應的抗原。該區(qū)域可通過膠體金或酶染色來顯色，從而實現(xiàn)待測物的特異性診斷。嚴智敏等［19］制備出一種用于創(chuàng)傷弧菌快速檢測的免疫層析試紙條，可在20～30 min內獲得檢測結果，檢出限為2×106CFU/mL，且對奇異變形桿菌和鮑曼不動桿菌等12株非目標菌無交叉反應。這種基于反應信號放大的快速診斷方法具有可視化、成本低廉、操作簡便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可滿足基層單位及現(xiàn)場檢測需求，無需專業(yè)人員即可定期進行檢測，有助于對病原體感染進行快速篩查，但該技術也存在不能精確定量、檢出限較高的問題。

3 分子生物學檢測技術

分子生物學檢測技術以DNA或RNA作為靶標序列，能夠實現(xiàn)目標菌株的快速自動化檢測，具有特異性強、可重復性好等特點。目前，應用于創(chuàng)傷弧菌的分子生物學檢測技術主要有PCR及其衍生技術、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）和重組酶聚合酶擴增（RPA）技術（表2）。

表2 創(chuàng)傷弧菌的分子生物學檢測方法比較Table 2 Comparison of molecular biological detection methods of V.vulni ficus

3.1 基于聚合酶鏈式反應的檢測技術

PCR及其衍生技術已廣泛應用于各種細菌檢測。與其他常規(guī)方法相比，基于PCR的方法顯示出更好的特異性、更高的靈敏度、更短的分析時間和更高的準確性［20－22］。應用于創(chuàng)傷弧菌檢測的PCR技術主要有常規(guī)PCR、多重PCR（mPCR）、最大可能數(shù)PCR（MNP－PCR）和實時PCR（RT－PCR）等。如圖1所示，Yin等［23］基于vvh A基因、膠原酶基因和t oxR基因開發(fā)了一種多次觸點聚合酶鏈式反應（MTPCR）方法，成功用于臨床樣本及環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的同時快速檢測。該方法對創(chuàng)傷弧菌的靈敏度可達104CFU/mL，對副溶血弧菌和溶藻弧菌的靈敏度均為103CFU/mL，特異性為100%。Tsai等［24］基于r poS、toxR、mecA、gcat、dnas eB和G B6個物種特異性基因的新組合構建mPCR法，同時檢測創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、A組鏈球菌和B組鏈球菌，結果表明該方法的準確率為87.5%。Baker－Austin等［25］利用靶向致病性創(chuàng)傷弧菌的pi lF基因開發(fā)的RT－PCR檢測法可在47株創(chuàng)傷弧菌分離株中成功檢測致病菌株，準確率達97.9%。Bonny等［26］將多重PCR與MNP技術相結合，建立了同時檢測創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌的多重MNP－PCR技術，其檢測結果與單重MNP－PCR無顯著性差異。

圖1 MT－PCR測定陽性臨床和環(huán)境樣品的部分結果［23］Fig.1 Partial results of positive clinical and environmental samples by MT－PCR assay［23］

3.2 核酸等溫擴增檢測技術

核酸等溫擴增是近年發(fā)展起來的新技術。該技術無需精良的設備，酶和DNA可在恒溫下進行反應，從而實現(xiàn)目標DNA片段的擴增。相比于PCR技術，核酸等溫擴增技術具有反應溫度更易控制、儀器設備簡單和加熱耗能少等優(yōu)點，故成為替代PCR的潛在技術。核酸等溫擴增技術主要有LAMP、鏈置換擴增（SDA）、RPA和聚合酶螺旋反應（PSR）等。其中，用于創(chuàng)傷弧菌檢測的核酸等溫擴增技術主要有LAMP和RPA技術。

LAMP是目前應用最廣泛的核酸等溫擴增技術，可快速檢測多種微生物［27－28］。Ren等［29］建立了快速檢測創(chuàng)傷弧菌的LAMP技術，靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。研究者還將LAMP與其他檢測技術相結合，極大提高了該方法的靈敏度。Han等［30］使用實時熒光LAMP技術和LAMP實時濁度法兩種方法定量檢測生蠔中的創(chuàng)傷弧菌。在對38個目標菌株和42個非目標菌株的檢測實驗中，兩種方法均無假陽性或假陰性結果，在生蠔加標樣本中的檢測靈敏度可達PCR技術的1 000倍。此外，Surasilp等［31］將橫向流動試紙法（LFD）與LAMP技術相結合，可精準檢測創(chuàng)傷弧菌污染的食物樣本，純培養(yǎng)物中的檢出限為每次反應2.8 CFU。

RPA技術的整個體系主要包括重組酶T4 UvsX、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶等［32］。2006年Piepenburg等［33］首次使用參與細胞內DNA合成、重組和修復的蛋白質開發(fā)了RPA技術，目前由TwistDX公司商業(yè)化（www.twistdx.co.uk）。相比于PCR，RPA不依賴溫控設備，無需熱變性，在常溫下即可完成擴增反應，適用于現(xiàn)場便攜式快速核酸檢測?？捎糜赗PA產物檢測的技術主要有側向流動試紙條法（LFS）、凝膠電泳和實時熒光定量檢測。Yang等［34］利用實時RPA建立了一種靶向創(chuàng)傷弧菌菌體外金屬蛋白酶（EMPV）基因的快速檢測方法。該方法的特異性良好，39℃下可在2～14 min內完成檢測，檢出限為每次反應17個基因拷貝或1 CFU。在臨床樣本檢測中，實時RPA的結果與生物測試和實時熒光定量PCR（qPCR）完全一致。需要注意的是，該方法可以抵抗食物基質的干擾，快速簡單，具有廣泛應用于食品安全控制中創(chuàng)傷弧菌檢測的可能性。如圖2所示，該課題組［35］進一步將具備可視信號的側向流動試紙條與RPA技術組合，開發(fā)了靶向創(chuàng)傷弧菌E M P V基因的RPA－LFS檢測法，其檢出限比實時RPA更低，可達到每次反應2個拷貝或0.1 CFU，富集4 h后可達1 CFU/10 g株菌加標食物樣品。Wang等［36］以霍亂弧菌的lolB基因和創(chuàng)傷弧菌的E M PV基因作為檢測標志物，建立了基于RPA－LFS的生物傳感器，用于同時雙靶標檢測霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌。該方法具有較好的特異性，檢出限為每次反應10個基因拷貝，且臨床樣品驗證結果與RT－PCR反應結果一致。該方法檢測過程簡單快速，37℃下反應30 min后，在5 min內即可實現(xiàn)試紙條帶上的可視化檢測。

圖2 RPA－LFS方法對創(chuàng)傷弧菌的檢出限［35］Fig.2 Detection limit of RPA－LFS for V.vulnif ic us［35］

4 新型檢測技術

4.1 生物芯片技術

生物芯片技術利用微縮法將一組識別配體如DNA、蛋白質、抗體等［37］固定在固體基質的特定位置上，用于檢測核酸、蛋白質和多糖等生物成分。該技術具有高效準確、高通量等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域表現(xiàn)出巨大的商業(yè)應用潛力。目前，應用于創(chuàng)傷弧菌檢測的生物芯片技術有DNA微陣列芯片和微流控芯片。

微陣列的原型是為檢測蠟狀芽孢桿菌［38］和產腸毒素的大腸桿菌［39］而創(chuàng)建。研究者們也將這一技術應用于創(chuàng)傷弧菌的檢測中。González等［40］結合多重PCR開發(fā)了一種基因特異性DNA微陣列，可同時檢測5種海洋魚類病原菌（創(chuàng)傷弧菌、鰻利斯頓氏菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、殺鮭氣單胞菌和副溶血弧菌）。Panicker等［41］用DNA微陣列技術偶聯(lián)多重PCR，用于同時檢測貝類中的副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌。對于無富集的純培養(yǎng)物，該方法的檢測靈敏度為102～103CFU/mL，特異性為100%。如圖3所示，經過5 h的樣品富集，其檢測靈敏度可達每克牡蠣組織勻漿中1 CFU，菌體的富集培養(yǎng)提高了該檢測技術的靈敏度。DNA微陣列的優(yōu)勢是能夠獲取病原體的詳細基因組信息，包括相關的種屬鑒定、分類型、毒力因子和抗生素抗性［37］，但也存在可重復性較差等缺點。

圖3 富集5 h后，DNA微陣列技術對牡蠣組織勻漿中副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌檢測的靈敏度［41］Fig.3 Sensitivity of detection for V.v ul nifi cus，V.parahae mol yt ic us and V.chole rae in seeded oyster tissue homogenates following 5 h of enrichment［41］

以微流控芯片技術為基礎的微全分析系統(tǒng)實現(xiàn)了生物樣本處理和檢測的一體化，不僅能將同一實驗的多個基本步驟集成到單個微小芯片上經一步反應完成，也能將多種實驗操作集成在一個實驗中完成［42］，在致病菌檢測應用中具有集成化程度高、小型化、高效簡便和節(jié)約試劑等特點。Jin等［43］報道了一種基于LAMP技術的微流控芯片，可用于檢測包括創(chuàng)傷弧菌在內的10種水源性致病菌。該方法能夠同時完成2個標本的22個遺傳分析，在純化細菌中的檢測范圍為每次反應7.92×10－3～9.54×10－1pg。如圖4所示，Zhou等［44］建立了一種基于實時熒光LAMP技術的雙樣本微流控芯片，可在30 min內同時檢測創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和腎壞死病毒等多種細菌和病毒。該方法對細菌基因組DNA的檢出限為100～10－1pg/μL；病毒重組質粒DNA的檢出限可達10－4～10－5pg/μL。且與常規(guī)微生物檢測方法相比，其臨床指標的敏感性和特異性分別為93.52%和85.53%，適用于水產養(yǎng)殖中多種病原體的現(xiàn)場檢測和常規(guī)監(jiān)測。

圖4 雙面樣品微流控芯片和等溫芯片檢測系統(tǒng)［44］Fig.4 Duplex sample microfluidic chip and isothermal chip detection system［44］

4.2 生物傳感技術

生物傳感器由識別元件、轉換器和信號檢測分析元件組成，通過對電化學、光學、溫度和壓電等不同類型信號的識別實現(xiàn)小型化和自動化的傳感檢測。該方法所需靶標的量低至nL及以下，可同步完成多種靶標分析。此種微量檢測不僅縮短了分析時間，還降低了試劑成本。生物傳感器已成為病原體直接檢測的有用工具，而微納技術的興起也進一步促進了生物傳感器的應用和發(fā)展［45］。

目前，生傳感器已成功應用于創(chuàng)傷弧菌的快速檢測。如圖5所示，F(xiàn)an等［46］構建了一種創(chuàng)傷弧菌體外檢測的脫氧核酶（DNAzyme）熒光傳感器。3'末端修飾羧基熒光素（FAM）且5'末端修飾猝滅劑的DNAzyme可與創(chuàng)傷弧菌胞外粗提物（CEM）反應從而被激活，反應激活后的DNAzyme切割底物而產生熒光信號。該DNAzyme傳感體系首先將普魯蘭多糖、海藻糖及DNAzyme混合添加到每個孔板中，經空氣干燥后將待測樣本加入到測試區(qū)使其相互反應，DNAzyme切割熒光底物產生的熒光信號經藍光凝膠成像系統(tǒng)檢測，檢出限為2.2×103CFU/mL，檢測時間為5～10 min。另外，創(chuàng)傷弧菌核酸適配體傳感器可以極大地提高臨床檢驗和食品安全監(jiān)控部門的工作效率，具有巨大的應用潛力。Yan等［47］結合不對稱PCR和指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）篩選出針對創(chuàng)傷弧菌的新型DNA適配體。研究結果表明，該DNA適配體對創(chuàng)傷弧菌具有較高的特異性與親和性，Kd為（26.8±5.3）nmol/L，檢測范圍為8～2.0×108CFU/mL。該研究為創(chuàng)傷弧菌核酸適配體傳感器的進一步開發(fā)奠定了基礎。

圖5 脫氧核酶（DNAzyme）熒光傳感器用于創(chuàng)傷弧菌的體外檢測［46］Fig.5 DNAzyme fluorescence sensor for detection of V.vulnif ic us i n vitr o［46］

5 總結與展望

近些年，隨著全球氣候變暖，創(chuàng)傷弧菌致病案例頻發(fā)，其檢測方法也在不斷發(fā)展。目前，常規(guī)的平板培養(yǎng)和生化鑒定方法仍是創(chuàng)傷弧菌檢測的標準方法，但該方法耗時較長，無法滿足高通量快速檢測需求。相比于傳統(tǒng)的檢測方法，免疫學及分子生物學檢測法在一定程度上縮短了檢測時間，但其所涉及的富集程序有待進一步優(yōu)化。因此，開發(fā)更好的細菌富集方法應是未來研究的重要方向之一。

值得注意的是，由于死細胞和活細胞中均存在DNA，PCR技術難以區(qū)分活細胞和非活細胞，通常會導致假陽性。且由于rRNA穩(wěn)定性強，細胞死亡后其降解速率較慢，以rRNA作為靶標檢測目標菌株也會產生假陽性結果。微流控芯片技術推動了菌體樣本處理和檢測的一體化發(fā)展，具備高通量優(yōu)勢，但較高的開發(fā)成本以及復雜先進的操作平臺使其難以普及，更無法應用于基層實驗室的細菌檢測中。而生物傳感器的優(yōu)勢在于其對微生物毒素和細菌的敏感性更高，只需少量樣品，檢測時間通常少于30 min，且納米材料的引入降低了該方法的檢出限，拓寬了檢測范圍，實驗操作更加簡便，還能實現(xiàn)現(xiàn)場、無標記的檢測。但在傳感過程中納米材料的結構及性能變化仍有待探索。生物傳感器也在朝著小型化、高通量系統(tǒng)和更高的集成度發(fā)展，從而能夠開發(fā)出手持式設備，以更簡單的支持系統(tǒng)、更快的響應時間和更低的成本對樣品進行現(xiàn)場分析。總體而言，各種檢測方法都存在優(yōu)缺點，實際應用中應綜合考慮選取適當?shù)臋z測技術，且多技術交叉聯(lián)合應用也已成為當下提高病原菌檢測準確性的發(fā)展方向。