袁真真，孫亞瑋，張 倩，張春陽

（山東師范大學 化學化工與材料科學學院，山東 濟南 250014）

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是一種廣泛分布在原核和真核細胞中的水解酶，它能夠在堿性條件下去除各種磷酸化底物的磷酸基團，催化磷酸單酯水解［1－2］。每個ALP分子由2個結(jié)構(gòu)相似的單體組成，每個單體含有2個鋅離子、1個鎂離子和5個半胱氨酸殘基［1，3］。ALP在人體中具有4種同工酶，分別為胎盤堿性磷酸酶、生殖細胞堿性磷酸酶、腸道堿性磷酸酶和組織非特異性堿性磷酸酶［2］。ALP廣泛存在于人體組織中，參與細胞周期、生長、凋亡和信號轉(zhuǎn)導等多種過程［4－7］。血清中的ALP主要來源于肝臟、骨骼和腎臟組織，其活性變化與多種疾病如骨質(zhì)疏松［8］、骨軟化［9］、膽道阻塞［10］、肝硬化［11］和敗血癥［12］等密切相關(guān)。同時，ALP是一些癌癥（例如骨癌［13］、胰腺癌［14］、卵巢癌［15］、乳腺癌［16－17］和前列腺癌［17］）的重要生物標志物。此外，ALP還能將一磷酸腺苷水解，生成可作為細胞信號分子的腺苷。因此，ALP的超靈敏檢測對于臨床疾病診斷和生物醫(yī)學研究具有重要意義。

近年來，一系列檢測ALP活性的方法相繼涌現(xiàn)，主要包括比色法［18－20］、電化學法［21－23］、表面增強拉曼散射法［24－26］和熒光分析法［27－28］。近紅外熒光探針的發(fā)展突破了ALP體外檢測的瓶頸，實現(xiàn)了從體外檢測到體內(nèi)成像［29－31］的跨越。本文主要綜述了近年來ALP的檢測和成像研究進展，并對該領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)及未來發(fā)展趨勢進行了展望。

1 ALP的體外檢測

1.1 比色法

比色法可通過直接觀察溶液的顏色變化或測定溶液的吸光度變化對待測組分進行定性/定量分析。Wu等［32］利用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）與氧化型四甲基聯(lián)苯胺（oxTMB）之間的顯色反應，合成了一種新型的仿氧化酶（FeCo NPs@PNC），用于檢測ALP活性（圖1A）。當ALP存在時，其催化L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽（AAP）水解為抗壞血酸（AA），AA進一步將藍色oxTMB還原為無色TMB。該方法的線性范圍為0.6～10 U·L－1，檢出限為0.49 U·L－1。FeCo NPs@PNC有望替代昂貴的天然酶和基于貴金屬的納米酶，在生物分析中顯示出巨大的潛力。Xie等［33］合成了一種具有過氧化物酶樣活性的Fe－N－C單原子納米酶（Fe/NC－SAs），用于檢測ALP活性。該方法的線性范圍為0.1～1.5 U·L－1，檢出限為0.05 U·L－1。該方法可進一步應用于人血清樣品中ALP活性的測定，在臨床疾病診斷中具有潛在應用價值。Zhou等［34］利用具有過氧化物酶模擬活性的Fe/C NS（Fe-doped carbon nanosheet），建立了一種檢測ALP活性的比色分析法。ALP能將磷酸苯二鈉水解為苯酚，F(xiàn)e/C NS在H2O2協(xié)助下催化苯酚與4-氨基安替比林的反應產(chǎn)生紅醌亞胺。該方法的線性范圍為0.05～6.00 U·L－1，檢出限為0.03 U·L－1。

圖1 FeCo NPs@PNC的合成步驟，F(xiàn)eCo NPs@PNC類氧化酶活性機制以及AA和ALP的檢測步驟［32］（A）；ALP的檢測原理示意圖［35］（B）Fig.1 Synthesis of the FeCo NPs@PNC，the mechanism of oxidase-like activity of the FeCo NPs@PNC，and the procedures for AA and ALP detection［32］（A）；schematic illustration of ALP assay［35］（B）

Mahato等［35］發(fā)展了一種紙基生物傳感器，將ALP抗體固定在功能化紙表面，制備了一種可與ALP免疫結(jié)合的傳感探針，用于檢測工業(yè)牛奶和原料奶樣品中ALP的活性（圖1B）。ALP催化5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽（BCIP）產(chǎn)生藍綠色復合物，利用智能手機拍攝該復合物，采用數(shù)字圖像比色法即可對ALP活性進行定量分析。該方法無需復雜昂貴的分析儀器，檢出限達0.87 U·mL－1，線性范圍為10～1 000 U·mL－1。

1.2 電化學法

電化學法能夠檢測電極表面的化學物質(zhì)在電子轉(zhuǎn)移過程中所產(chǎn)生的電信號變化，具有選擇性好、成本低和攜帶方便等優(yōu)點。二茂鐵具有易于衍生化和良好的電化學性質(zhì)［36－38］，通常用作電化學探針的氧化還原活性基團。同時，二茂鐵在水中的穩(wěn)定性較好［39］，促進了二茂鐵衍生物在生物領(lǐng)域的應用。Goggins等［40］開發(fā)了一種基于ALP催化二茂鐵苯基磷酸鹽轉(zhuǎn)化成氨基二茂鐵（AFC）反應的比率電化學方法（圖2A）。當ALP存在時，它催化二茂鐵苯基磷酸鹽去磷酸化產(chǎn)生酚類中間體。酚類中間體不穩(wěn)定，釋放出AFC、等量亞甲基苯醌和CO2。二茂鐵苯基磷酸鹽與AFC的電勢不同，對兩者在微分脈沖伏安（DPV）信號中的峰面積積分可計算出轉(zhuǎn)換率，進而對ALP活性進行檢測。該方法通過電化學比率法測定ALP活性，能夠有效避免由采樣和變更電極/儀器所引起的誤差。類似地，Wang等［41］發(fā)展了一種利用氨基二茂鐵檢測ALP活性的電化學方法（圖2B）。當ALP不存在時，AFC通過與磷酸基結(jié)合的方式固定在單鏈DNA上，產(chǎn)生電信號。當ALP存在時，單鏈DNA的5'端被去磷酸化，不能與AFC探針相連，無法產(chǎn)生電信號。該方法的檢出限可達1.48 mU·mL－1，線性范圍為20～100 mU·mL－1，具有操作簡單、快捷和成本低的優(yōu)點。最近，Zhu等［42］發(fā)展了一種基于開環(huán)聚合信號放大策略檢測ALP活性的電化學傳感器。該傳感器的靈敏度高，檢出限達0.66 mU·mL－1，線性范圍為20～120 mU·mL－1。該傳感器對人血清樣本具有良好的選擇性和抗干擾性，檢測結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)的相對誤差小于5%，在臨床診斷中具有潛在應用價值。

圖2 二茂鐵苯基磷酸鹽的結(jié)構(gòu)和ALP催化氨基二茂鐵的降解機理［40］（A）；基于酶催化反應的電化學方法檢測ALP活性的原理圖［41］（B）Fig.2 Structure of ferrocenylphenyl phosphate and the mechanism of ALP-catalysed breakdown with the subsequent release of ferrocenylamin［40］（A）；schematic illustration for electrochemical detection of ALP activity based on enzymecatalyzed reaction［41］（B）

將酶介導的信號放大反應引入電化學傳感器的構(gòu)建，可顯著提高檢測靈敏度。Zhang等［43］發(fā)展了一種基于T7外切酶輔助信號放大的均相電化學生物傳感器，用于檢測ALP活性（圖3A）。該研究組設計了一個3'-磷酸化和5'-亞甲基藍標記的發(fā)夾探針，當ALP存在時，發(fā)夾探針中的3'-磷酸基團去磷酸變成3'-羥基。隨后，KF DNA聚合酶對3'-羥基進行延伸，啟動T7核酸外切酶降解發(fā)夾探針中的雙鏈，釋放亞甲基藍標記的單核苷酸和觸發(fā)DNA探針。觸發(fā)DNA探針能夠與新的發(fā)夾探針雜交，啟動循環(huán)切割過程，釋放大量亞甲基藍標記的單核苷酸，產(chǎn)生增強的電化學信號。此方法能在均相溶液中進行，無需復雜的電極修飾過程，檢出限為0.1 U·L－1。Liu等［44］發(fā)展了一種基于末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal transferase，TdT）介導的無模板擴增和血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶的電化學傳感器，可靈敏檢測ALP活性（圖3B）。將巰基功能化的DNA 1和3'-磷酸化的DNA 2形成的雙鏈DNA探針固定在金納米顆粒修飾的玻碳（GC）電極上。當ALP存在時，它催化DNA 2的3'-磷酸基團水解，產(chǎn)生3'-羥基端。隨后，TdT催化DNA 2的3'-羥基端延伸出聚T序列。DNA 2的聚T序列能夠與富含堿基G的DNA 3的聚A片段雜交，在血紅素存在時形成血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶。血紅素/G-四聯(lián)體脫氧核酶可將還原型輔酶Ⅰ（NADH）氧化成輔酶Ⅰ（NAD+）并產(chǎn)生H2O2，H2O2會進一步被血紅素/G-四聯(lián)體脫氧核酶催化，在硫堇（Thi）作為電子傳遞介質(zhì)時產(chǎn)生增強的電化學信號。該方法的靈敏度高，檢出限可達0.03 U·L－1，線性范圍為0.1～5 U·L－1。且該生物傳感器具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖3 均相電化學法檢測ALP活性［43］（A）與基于DNA的電化學生物傳感器檢測ALP［44］（B）的原理示意圖Fig.3 Principles of homogeneously electrochemical detection of ALP activity［43］（A）and DNA-based electrochemical biosensor for ALP activity assay［44］（B）

1.3 表面增強拉曼散射法

表面增強拉曼散射（SERS）是由于拉曼探針與貴金屬納米表面接近而產(chǎn)生，主要來自于金屬粒子表面等離子體共振的光激發(fā)，可以提供分子特異性指紋光譜。Sun等［45］利用表面增強共振拉曼散射（SERRS）結(jié)合液滴微流控技術(shù)，對單細胞中ALP活性進行靈敏檢測（圖4A）。當BCIP與細胞共孵育時，ALP能催化無色的BCIP水解，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物經(jīng)氧化生成藍色物質(zhì)5，5'-二溴-4，4'-二氯-1H，1H-［2，2'］雙吲哚基-3，3'-二酮（BCI），BCI可以產(chǎn)生拉曼信號。該方法的檢出限達1.0×10-15mol/L。

圖4 SERRS結(jié)合液滴微流控法檢測單細胞中ALP活性［45］（A）、基于MnO2殼層厚度依賴性的結(jié)晶紫拉曼信號檢測ALP活性［46］（B）以及用于ALP活性比率檢測的AMAM SERS納米探針［47］（C）的原理示意圖Fig.4 Schematic illustrations of the droplet-based microfluidic SERRS method for the detection of ALP activity in single cell［45］（A），ALP activity detection based on the MnO2 shell thickness-dependent SERS signal from crystal violet［46］（B），and the AMAM SERS nanoprobe for ratiometric sensing of the alkaline phosphatase activity［47］（C）

Liu等［46］開發(fā)了一種基于金納米雙錐體@MnO2納米顆粒（Nanobipyramids@MnO2nanoparticles，AMNS）的SERS方法，用于檢測ALP活性（圖4B）。ALP可將AAP水解為AA，AA能將MnO2還原為Mn2+，進而蝕刻AMNS的外殼，增強電磁場，導致吸附在金納米雙錐體表面上的結(jié)晶紫（CV）的拉曼信號強度增強。該方法的檢出限為0.04 mU·mL－1，線性范圍為0.4～20 mU·mL－1，有效克服了傳統(tǒng)SERS方法標記效率低和耗時長的問題，在生物樣品分析中具有良好的應用前景。另外，最新發(fā)展的比率型SERS納米探針能有效減少實驗干擾，提高SERS定量分析的準確度。Dai等［47］開發(fā)了一種SERS納米探針（Au－Mpy－Au－MnO2，AMAM），用于定量檢測血清中ALP的活性（圖4C）。MnO2殼層具有較強的拉曼振動信號I（MnO2），可以作為拉曼參考。AMAM探針中4-巰基吡啶（Mpy）的拉曼強度I（Mpy）隨著MnO2殼層的蝕刻而增強。該方法以I（Mpy）/I（MnO2）作為輸出信號，可同時進行比色和SERS分析，檢出限為0.079 U·L－1，線性范圍為0.1～70 U·L－1。該方法可用于直接檢測未稀釋的微量人血清中ALP的活性。

1.4 熒光分析法

熒光發(fā)射是指物質(zhì)被一定波長的光照射后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子通過輻射返回基態(tài)時發(fā)射出光量子的過程。熒光分析法可用于待測物質(zhì)的定性和定量檢測。ALP的熒光檢測方法具有靈敏度高、選擇性好和背景干擾小的優(yōu)點［48－51］。Zhang課題組［52］構(gòu)建了一種基于循環(huán)擴增反應的熒光分析方法，可靈敏檢測ALP活性（圖5A）。首先，T7啟動子與模板鏈雜交形成雙鏈DNA。當ALP存在時，T7啟動鏈5'端因去磷酸化而不能被λ外切酶（λ-exo）降解。T7啟動鏈在T7 RNA聚合酶作用下激活轉(zhuǎn)錄反應，產(chǎn)生大量單鏈RNA（ssRNAs）。生成的單鏈RNA可與兩端分別標有熒光基團羥基熒光素（FAM）和猝滅基團Eclipse的Taqman探針雜交形成RNA/DNA雜交體。雙特異性核酸酶（DSN）能夠降解Taqman探針，導致FAM熒光恢復，并釋放單鏈RNA。釋放的單鏈RNA可與新Taqman探針雜交，誘導循環(huán)降解Taqman探針，產(chǎn)生增強FAM熒光信號。該方法的靈敏度高，檢出限達0.02 U·L－1，線性范圍為0.05～1 U·L－1。Ma等［53］發(fā)展了一種僅需1種連接酶即可實現(xiàn)信號放大的量子點納米傳感器，用于ALP的靈敏檢測（圖5B）。當ALP存在時，它可以催化檢測探針3'-磷酸末端去磷酸化，生成3'-羥基末端。3'羥基化的檢測探針、5'磷酸化的輔助探針和模板可形成檢測探針－輔助探針－模板的“三明治”結(jié)構(gòu)。在連接酶作用下，檢測探針與輔助探針連接成一個二級模板。二級模板經(jīng)過變性可與生物素（Biotin）標記的探針和5H-吲哚菁（Cy5）標記的探針形成biotin－Cy5探針。經(jīng)過無數(shù)個退火－連接－變性循環(huán)過程，可以產(chǎn)生大量biotin－Cy5雙標記信號探針。該探針能夠自組裝到表面修飾有鏈霉親和素的量子點上，形成605 QD/信號探針/Cy5“三明治”結(jié)構(gòu)，在605 QD和Cy5之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生Cy5信號。該方法的檢出限可達5.63×10－7U·mL－1，線性范圍為1×10－6～1×10－1U·mL－1。方法非常簡單，只需1種連接酶即可完成信號擴增，有效簡化了實驗步驟。

Wang等［54］設計了一種基于循環(huán)指數(shù)擴增反應的ALP熒光檢測方法（圖5C）。當ALP存在時，3'磷酸化的引物被去磷酸化，與發(fā)夾探針1（HP 1）的3'凸出端雜交，啟動第一次鏈置換擴增（SDA），產(chǎn)生觸發(fā)引物1（Trigger 1）和熒光信號。釋放的觸發(fā)引物1與發(fā)夾探針2（HP 2）的3'凸出端雜交，以啟動第二次SDA，產(chǎn)生觸發(fā)引物2（Trigger 2）和熒光信號。觸發(fā)引物2又可與HP 1的3'凸出端雜交，啟動兩個連續(xù)的SDA，產(chǎn)生增強的熒光信號。該方法可在等溫條件下進行，靈敏度高，檢出限達2.0×10-10U·μL-1，線性范圍為1×10－9～1×10－4U·μL－1。

Wang等［55］發(fā)展了一種更為簡單的熒光方法，可一步定量檢測人血清中的ALP（圖5D）。該研究組設計了一種功能化的寡核苷酸探針－聚腺嘌呤分子信標（Poly－A MB），Poly－A MB上標記有1個BHQ1和1個彼此靠近的熒光團FAM，其3'末端修飾了1個磷酸基團，Poly－A被嵌入環(huán)中。當ALP存在時，它催化Poly－A MBs的3'端去磷酸化，誘導TdT介導的無模板擴增反應，產(chǎn)生長鏈聚胸腺嘧啶（Poly－T）序列。長鏈Poly－T可作為模板與多個Poly－A MBs雜交，導致Poly－A MBs環(huán)結(jié)構(gòu)的展開和FAM/BHQ1的分離。隨后，3'-羥基化的Poly－A MBs在TdT作用下延伸，生成分支長鏈Poly－T，導致大量FAM/BHQ1分離。經(jīng)過循環(huán)延伸－組裝－激活，Poly－A MBs自組裝形成樹突狀DNA納米結(jié)構(gòu)，導致大量FAM/BHQ1分離，產(chǎn)生指數(shù)放大的熒光信號。該方法的檢出限為3.2×10－7U·μL－1，線性范圍為5×10－7～1×10－3U·μL－1。該方法僅需1個DNA探針和1種工具酶，可在等溫條件下一步完成ALP活性檢測，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點。

圖5 基于去磷酸化啟動的轉(zhuǎn)錄反應介導的雙信號擴增方法檢測ALP活性的示意圖［52］（A）；基于連接酶擴增反應的單量子點納米傳感器檢測ALP活性的示意圖［53］（B）；基于引物去磷酸化啟動的循環(huán)指數(shù)擴增方法檢測ALP活性的示意圖［54］（C）；3'端修復驅(qū)動的Poly－A分子信標自組裝形成樹突狀納米傳感器一步定量檢測人血清中ALP的示意圖［55］（D）Fig.5 Schematic illustration of ALP assay based on dephosphorylation-initiated transcription reaction-mediated dual signal amplification［52］（A）；schematic illustration of ligase amplification reaction-catalyzed assembly of a single QD-based nanosensor for ALP assay［53］（B）；schematic illustration of ALP assay based on primer dephosphorylation-initiated circular exponential amplification［54］（C）；schematic illustration of the 3'-terminal repair-powered dendritic nanoassembly of Poly-A molecular beacons for one-step quantification of ALP in human serum［55］（D）

2 ALP的體內(nèi)成像

應當指出的是，上述方法大多不適用于細胞內(nèi)成像。與傳統(tǒng)的在可見波長范圍內(nèi)使用的熒光探針相比，近紅外（NIR）熒光探針能夠在NIR光譜區(qū)域成像，對生物體造成的光損傷小，受內(nèi)源性組織自身熒光的干擾小［56］。Liu等［57］發(fā)展了一種基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）原理，可用于活體檢測ALP的近紅外熒光探針NALP（圖6A）。當ALP不存在時，磷酸基團保護NIR熒光團的羥基，使其無法發(fā)射熒光；當ALP存在時，磷酸基團被催化水解，釋放NIR熒光團，產(chǎn)生增強的熒光信號。該探針具有良好的細胞膜通透性和極小的細胞毒性，線性范圍為1～30 U·L－1，檢出限達0.28 U·L－1，可用于裸鼠活細胞和腫瘤組織中內(nèi)源性ALP的活體成像。類似地，Li等［58］發(fā)展了一種基于半水楊酸的近紅外熒光探針CyP，可用于細胞、組織和動物活體內(nèi)ALP的檢測。

Park等［59］合成了2種NIR探針（NIR－Phos-1和NIR－Phos-2），用于快速靈敏檢測ALP活性。該NIR探針包含1個酚類二氫基蒽熒光團中心和1個添加磺酸基的磷酸鹽（以增強其在水中的溶解度）。這兩種NIR探針本身不發(fā)熒光，但經(jīng)ALP催化去磷酸化后可以發(fā)出較強熒光。將NIR探針標記的骨樣3D CDHA支架植入裸鼠皮下，可用于檢測活體內(nèi)的ALP活性。該探針的靈敏度高、選擇性好，可在1.5 min內(nèi)產(chǎn)生應答，對NIR－Phos-1和NIR－Phos-2的檢出限分別為10－5U·mL－1和10－3U·mL－1，可用于活細胞和小鼠內(nèi)源性ALP的原位成像。

單波長發(fā)射探針易受多種因素（例如光漂白、探針的不均勻分布和儀器變化）的影響。比率熒光探針可以有效地克服這些干擾，提高檢測的準確度［60－62］。Zhang等［63］設計了一種NIR比率熒光探針APT（圖6B），用于實時檢測ALP活性。當ALP不存在時，該探針的末端氨基（TMN）與1個吸電子酯基團相連，導致電子云分散，APT發(fā)出黃色熒光。當ALP存在時，氨基與ALP發(fā)生特異性反應，TMN電子云通過一系列的電子轉(zhuǎn)移和自溶過程恢復，發(fā)出紅色熒光。該探針具有響應時間短（小于10 min）、檢測線性范圍寬、熒光背景低、適用于組織成像等優(yōu)點，可用于監(jiān)測斑馬魚器官損傷引起的內(nèi)源性ALP升高，在病理分析中具有潛在的應用價值。

基于聚集誘導發(fā)射（AIE）原理的AIEgens（AIE luminogens）探針能夠有效限制分子內(nèi)運動，提高成像分辨率和原位成像能力［64－65］。Li等［66］合成了一種可激活的AIEgens探針DQM－ALP，用于ALP活性成像（圖6C）。利用疏水的喹啉－丙二腈（QM）衍生物作為AIE核心，親水的磷酸基作為ALP識別單元。DQM－ALP分子在體外具有明顯的熒光猝滅特征。ALP可以激活該探針，誘導DQM－OH原位聚集，從而限制其分子內(nèi)運動，產(chǎn)生AIE熒光。該方法的檢出限為0.15 mU·mL－1，線性范圍為0～60 mU·mL－1，可以有效區(qū)分小鼠正常組織和癌變組織。

圖6 NIR熒光探針NALP的結(jié)構(gòu)及其對ALP的響應機制［57］（A）；利用NIR比率探針對活體內(nèi)ALP成像的原理示意圖［63］（B）；DQM－ALP的組裝及AIE在體外和細胞內(nèi)的激活過程示意圖［66］（C）Fig.6 Structure of NIR fluorescent probe NALP and the response mechanism of NALP towards ALP［57］（A）；schematic illustration for i n vivo imaging of ALP activity using the NIR ratiometric probe［63］（B）；schematic illustration of the assembly of DQM－ALP and process of AIE activation i n vi tro and in cell［66］（C）

3 結(jié)論與展望

ALP是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的可以催化蛋白質(zhì)、核酸和小分子去磷酸化的水解酶，其活性失調(diào)與多種疾?。ɡ绻琴|(zhì)疏松、骨軟化、膽道阻塞、肝硬化、敗血癥和癌癥）密切相關(guān)，因而ALP活性分析對疾病診斷具有重要意義。在目前已開發(fā)的ALP活性檢測方法中，比色法具有結(jié)果直觀且無需復雜昂貴儀器的優(yōu)點，但靈敏度偏低，為了獲得更好的比色效果，迫切需要開發(fā)具有更好顯色性能的新探針。電化學法具有選擇性好、成本低和儀器便攜的優(yōu)點，但存在信號相對較弱、靈敏度較低、ALP底物合成復雜和需使用多種工具酶等缺陷，需要逐一解決和克服。表面增強拉曼散射法具有靈敏度高和能夠提供分子特異性指紋光譜的優(yōu)點，然而操作復雜和拉曼信號不穩(wěn)定仍是迫切需要解決的問題。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、原位實時、背景干擾小和具備活體成像能力的優(yōu)點，但在檢測特異性、熒光穿透、成像分辨率方面仍存在一定的局限性?；贜IR探針和AIEgens探針的活體成像實現(xiàn)了從體外檢測到體內(nèi)成像的跨越，但很難實現(xiàn)準確定量，同時在區(qū)分堿性磷酸酶的亞型方面還存在不足。通過對ALP檢測研究的回顧，不難發(fā)現(xiàn)ALP檢測方法的持續(xù)快速發(fā)展在很大程度上取決于納米材料和DNAzymes等新型材料的發(fā)現(xiàn)以及這些新型材料與ALP的生物相容性，因此，開發(fā)更多與ALP具有生物相容性的新型材料可能是未來ALP活性檢測領(lǐng)域的研究熱點。值得關(guān)注的是，單分子檢測作為一種近年來涌現(xiàn)的新技術(shù)具有樣品消耗低和靈敏度高等優(yōu)點，在ALP活性檢測研究中具有廣闊的應用前景。另外，鏈置換擴增、滾環(huán)擴增和連接酶鏈式反應等新型高效擴增技術(shù)的引進，將極大促進ALP活性檢測方法的飛速發(fā)展。