陳 明，陳 鵬，王 靜，宋春雷，黃克和

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400）

隨著我國畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，優(yōu)質(zhì)粗飼料資源短缺，高效利用飼料原料、開發(fā)新的飼料資源迫在眉睫。我國是食用菌生產(chǎn)大國，2019年食用菌生產(chǎn)總量為3.96×108t[1]。每100 g 基質(zhì)料生產(chǎn)鮮菇可產(chǎn)生60 g 菌渣，每年約產(chǎn)生2.37×108t菌渣[1-2]。目前，食用菌菌渣的處理方法主要是丟棄或焚燒，會造成資源浪費、污染環(huán)境[3]。菌渣來源廣泛，富含粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、微量元素、氨基酸及其他營養(yǎng)成分[4]。菌渣具有特定香味，顆粒小或呈粉末狀，適口性、可消化性較好，可直接或加工后飼喂畜禽，是潛在的飼料資源[3]。但菌渣也含有一些有害物質(zhì)，如霉菌毒素、單寧等，直接飼喂動物可能會阻礙動物的生長發(fā)育，降低生產(chǎn)性能[5]。呂文婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在AA肉雞配合飼料中添加少量平菇菌糠可提高日增重，降低料重比，提高經(jīng)濟效益。張書良等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在肉鵝飼料中添加不同比例的杏鮑菇菌渣可提高肉鵝日增重和經(jīng)濟效益。郭萬正等[8]在波爾山羊基礎(chǔ)日糧中添加發(fā)酵金針菇菌糠，結(jié)果顯示，各組生長性能無顯著差異，生理生化指標均無顯著差異。

固態(tài)發(fā)酵指在固態(tài)基質(zhì)中的微生物發(fā)酵，發(fā)酵基質(zhì)中幾乎沒有可以自由流動的水[9]。固態(tài)發(fā)酵具有可保持微生物原始的生長狀態(tài)、利于發(fā)酵代謝產(chǎn)物的積累與多樣性、培養(yǎng)基質(zhì)含水量低、不需要液態(tài)發(fā)酵的廢水處理、環(huán)境友好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點[10]?？莶菅挎邨U菌的芽孢營養(yǎng)體易保存，可作為微生物飼料的發(fā)酵菌種[10-12]?？莶菅挎邨U菌在生長代謝過程中能夠分泌大量抗菌肽、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等活性物質(zhì)，能夠促進畜禽營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)化率，增強機體免疫力，可利用枯草芽孢桿菌的發(fā)酵特性提升飼料的消化利用率。本試驗采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌渣的固態(tài)發(fā)酵方法優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在獲得適口性較好的微生物飼料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種復壯

枯草芽孢桿菌菌種由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院畜牧獸醫(yī)學院益生菌研究組提供。

將冷凍的枯草芽孢桿菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)，傳代3次復壯，4 ℃保存，枯草芽孢桿菌菌液活菌數(shù)量為1×107CFU/mL。

1.1.2 菌渣

新鮮金針菇菌渣由南京金萬辰生物科技有限公司提供，金針菇生產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)原料組成見表1。鮮金針菇菌渣主要化學成分及有關(guān)指標見表2。

表1 金針菇生產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)原料組成Tab.1 Substrate composition of Flammulina velutipes production culture medium 單位：%

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL，加熱攪拌，校正pH值至7.2～7.4，121.3 ℃高壓滅菌30 min，倒入錐形瓶，冷卻，4 ℃保存。

表2 鮮金針菇菌渣主要化學成分及相關(guān)指標Tab.2 Proportion of chemical composition and related indexes in fresh Flammulina velutipes residue

固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉25 g、蒸餾水1 000 mL，加熱攪拌，校正pH值至7.2～7.4；121.3 ℃高壓滅菌30 min，倒入玻璃培養(yǎng)皿，冷卻凝固后倒置，4 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

探究枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌渣的接種比例、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等影響因素。將發(fā)酵產(chǎn)物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定枯草芽孢桿菌活菌數(shù)量，探究各因素的最適條件范圍。

1.2.1.1 菌渣發(fā)酵的最佳接種比例

試驗分兩次進行，探究枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌渣的水分需求以及菌種接種比例。

第1次試驗，無菌玻璃培養(yǎng)皿編號1～6，分別加入0、2、4、6、8、10 mL蒸餾水，各加2 mL枯草芽孢桿菌液和10 g金針菇菌渣，混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察發(fā)霉情況。

第2次試驗，無菌玻璃培養(yǎng)皿編號0～6，分別加入0、1、2、3、4、5、6 mL枯草芽孢桿菌液和10 g金針菇菌渣，混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察發(fā)霉情況。

1.2.1.2 菌渣發(fā)酵的最佳溫度

采用不同溫度（31、34、37、40 ℃），發(fā)酵時間24 h，枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合液初始pH值為7.0，每組5個重復。

將發(fā)酵產(chǎn)物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察發(fā)霉情況并測定枯草芽孢桿菌數(shù)量。

1.2.1.3 菌渣發(fā)酵的最適時間試驗分兩次進行。

第1 次試驗繪制枯草芽孢桿菌在菌渣中的生長曲線，初步了解培養(yǎng)時間?？莶菅挎邨U菌液與菌渣的接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合物初始pH 值為7.0，溫度34 ℃，分別培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、28、32 h；采取不同時間點的發(fā)酵產(chǎn)物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定枯草芽孢桿菌數(shù)量。

第2次試驗根據(jù)第1次試驗的結(jié)果明確培養(yǎng)時間。采用不同培養(yǎng)時間（16、20、24、28 h），溫度34 ℃，枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合液初始pH值為7.0，每組5個重復；發(fā)酵產(chǎn)物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定枯草芽孢桿菌數(shù)量。

1.2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過L9（33）正交試驗和曲線回歸分析確定接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響程度及最適發(fā)酵條件。

正交試驗因素水平見表3。

表3 L9（34）正交試驗因素水平設計Tab.3 L9(34)orthogonal test factor level design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，繪制不同發(fā)酵時間細菌生長分布圖，采用SPSS 軟件進行多因素方差分析和二次曲線回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 接種比例的確定

第1 次試驗加入蒸餾水菌渣培養(yǎng)后，均有較多霉菌長出，不加蒸餾水的培養(yǎng)后霉菌較少或未見；第2次試驗不加蒸餾水，不同接種比例的培養(yǎng)結(jié)果見表4。

根據(jù)兩次試驗結(jié)果分析，初步推斷，金針菇菌渣發(fā)酵的枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣比例為4∶10～6∶10 mL/g時，發(fā)酵效果較好。

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定（見圖1）

由圖1 可知，枯草芽孢桿菌液與菌渣的接種比例為5∶10 mL/g，菌渣混合物于初始pH 值為7.0，發(fā)酵時間24 h條件下，34、37 ℃細菌生長情況優(yōu)于31、40 ℃，4種發(fā)酵溫度下均未見發(fā)霉現(xiàn)象，初步確定發(fā)酵最適溫度范圍為34～37 ℃。

表4 不同接種比例的培養(yǎng)結(jié)果Tab.4 Cultural results influenced by different inoculated proportion

2.1.3 發(fā)酵時間（見圖2、圖3）

由圖2 可知，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)4 h 后進入對數(shù)生長期，16 h后生長速度減慢，16～24 h為穩(wěn)定期，24 h后進入衰退期。

圖2 菌渣中不同時間枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.2 Growth curve of Bacillus subtilis in different duration points

由圖3可知，20、24 h的細菌生長情況優(yōu)于16、28 h，故確定發(fā)酵時間范圍為20～24 h。

通過單因素試驗，初步確定菌渣發(fā)酵的枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣的最佳比例為4∶10～6∶10 mL/g，最適發(fā)酵溫度為34～37 ℃，最適發(fā)酵時間為20～24 h。

2.2 正交試驗結(jié)果（見表5、表6）

圖3 不同發(fā)酵時間的細菌數(shù)量Fig.3 Number of bacteria colonized in different fermented duration

表5 正交試驗結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal test

由表5可知，接種比例對固態(tài)發(fā)酵中枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)量影響最大，其次是發(fā)酵時間，發(fā)酵溫度影響最小。

表6 正交試驗方差分析Tab.6 Analysis of variance of orthogonal test

由表6可知，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種比例為活菌量的99.4%變化原因，其中，接種比例對活菌量有極顯著影響（P＜0.01），發(fā)酵時間對活菌量有顯著影響（P＜0.05），發(fā)酵溫度對活菌量不顯著。

各因子對發(fā)酵效果影響程度：接種比例＞發(fā)酵時間＞一定范圍內(nèi)的發(fā)酵溫度，與極差分析結(jié)果一致。

2.3 最適條件曲線回歸分析（見圖4～圖6）

由圖4可知，發(fā)酵時間為24 h時，枯草芽孢桿菌活菌量最多，效果最佳。

圖4 發(fā)酵時間與活菌量的擬合曲線Fig.4 Fitting curve on fermented duration and number of live bacteria

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果無明顯影響。

圖5 發(fā)酵溫度與活菌量的擬合曲線Fig.5 Fitting curve on fermented temperature and number of live bacteria

由圖6 可知，枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣的比例為6∶10 mL/g時效果最佳。

圖6 接種比例與活菌量的擬合曲線Fig.6 Fitting curve on inoculated proportion and number of live bacteria

確定最適發(fā)酵條件為發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度34 ℃、枯草芽孢桿菌液與金針菇菌渣的比例為6∶10 mL/g。

2.4 最適發(fā)酵條件的驗證（見圖7、圖8）

由圖7可知，最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)物稀釋至106倍，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵后細菌生長良好，分布均勻，菌落大小正常，無霉菌生長。

由圖8可知，經(jīng)革蘭氏染色無雜菌污染。

圖7 枯草芽孢桿菌菌落生長情況Fig.7 Colony growth of Bacillus subtilis

圖8 枯草芽孢桿菌鏡檢Fig.8 Microscopic test on Bacillus subtilis

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)量和衛(wèi)生指標的測定

在最適發(fā)酵條件下，測得發(fā)酵菌渣產(chǎn)物中活菌數(shù)量為7.5×108CFU/g，符合發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程的要求（TQBAA 001—2009）[12]。有毒有害物質(zhì)黃曲霉毒素B1的含量＜0.15 μg/kg，符合國家飼料衛(wèi)生標準的要求（GB 13078—2017）[13]。

3 討論

3.1 細菌生長營養(yǎng)需求

新鮮金針菇菌渣水分含量為55.26%，枯草芽孢桿菌菌液與菌渣比例為6∶10 mL/g的混合物水分含量為64.33%，發(fā)酵產(chǎn)物水分含量為64.13%，表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌渣的水分含量充足。菌渣自身的麩皮、玉米、細米糠、棉籽殼、菌絲體等富含碳源和氮源，能夠滿足枯草芽孢桿菌生長需求。菌渣菌液混合物的初始pH值約為7.0，不需再做調(diào)整，更接近生產(chǎn)實際，適合規(guī)?；a(chǎn)。

3.2 固態(tài)發(fā)酵與條件

細菌生長的主要影響因素為培養(yǎng)基營養(yǎng)、水分含量、初始pH 值、外界溫度及培養(yǎng)時間。本研究采用益生菌于無游離水基質(zhì)上的固態(tài)發(fā)酵方式，發(fā)酵中產(chǎn)生的熱量可促進水分蒸發(fā)，利于保持發(fā)酵產(chǎn)物的低水分含量[14]，也可減少水分含量高引起發(fā)霉的現(xiàn)象，方便后期烘干貯藏和直接飼喂或與其他飼料混合。

不同接種菌液的比例導致固態(tài)發(fā)酵中水分含量不同，對枯草芽孢桿菌的生長結(jié)果具有一定影響?？莶菅挎邨U菌液與金針菇菌渣的接種比例為6∶10 mL/g 時，發(fā)酵效果較好，霉菌生長受到抑制；降低接種比例時，桿菌生長較好但無法有效抑制霉菌生長。

培養(yǎng)時間可影響細菌生長。枯草芽孢桿菌在液態(tài)培養(yǎng)基中適應期約為6 h，且固態(tài)發(fā)酵中水分和營養(yǎng)成分均低于液態(tài)培養(yǎng)基。本研究中金針菇菌渣發(fā)酵的適應期延長，培養(yǎng)4 h 后進入對數(shù)生長期；隨著菌渣中營養(yǎng)被利用，培養(yǎng)至22 h 時，生長速度進入穩(wěn)定期，24 h 后細菌數(shù)量不再上升。

培養(yǎng)溫度液可影響細菌生長，一般細菌適宜生長溫度為37 ℃。菌渣固態(tài)發(fā)酵時，可產(chǎn)生一定的熱量；枯草芽孢桿菌抗逆性強，發(fā)酵溫度為34 ℃時，繁殖速度及數(shù)量與37 ℃無顯著差異，與文獻報道一致[15]。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌渣最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度34 ℃、發(fā)酵時間24 h、枯草芽孢桿菌菌液與金針菇菌渣接種比例為6∶10 mL/g，活菌數(shù)符合發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求，黃曲霉毒素含量符合飼料衛(wèi)生標準要求。