汪 健，胡 毅，陳開健，鐘 蕾，符貴紅，石 勇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南長沙 410128）

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，人工養(yǎng)殖日漸趨于規(guī)模化與集約化，水產(chǎn)動物易受各種病害的威脅。抗生素具有易于獲得、使用方便、效果顯著等多種優(yōu)勢，常應(yīng)用于防治水產(chǎn)病害問題。水產(chǎn)動物長期使用抗生素易產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生的耐藥菌株威脅人類公共衛(wèi)生安全，同時(shí)也會破壞養(yǎng)殖水體的微生態(tài)。此外，隨著全面禁抗實(shí)施，尋求抗生素的有效替代物迫在眉睫。

近年來，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用與相關(guān)研究逐漸成為熱點(diǎn)。中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用中表現(xiàn)出多種優(yōu)點(diǎn)，如價(jià)格低、藥物殘留少、無耐藥性等。目前，已有多種天然的抗菌生物堿在PubMed及Science Direct公布，血根堿是其中最為有效的天然抗菌生物堿之一，在水產(chǎn)替抗與健康養(yǎng)殖的研究中頗受關(guān)注[1]。本文針對血根堿的相關(guān)研究進(jìn)展展開綜述，以期為血根堿作為水產(chǎn)飼用免疫增強(qiáng)劑提供參考，推動血根堿在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究應(yīng)用。

1 血根堿概況

血根堿（sanguinarine）多存在于博落回、白屈菜、血水草等植物中，經(jīng)二氫苯并啡啶氧化酶氧化二氫血根堿形成[2]，為苯菲啶異喹啉類生物堿。血根堿分子式為C20H15O5N，相對分子質(zhì)量332，熔點(diǎn)為265～267℃，提純后為粉末狀固體，呈紅黃色，分子結(jié)構(gòu)式見圖1。2004年，歐盟通過了以血根堿為主要功能成分之一的飼料添加劑的注冊，隨后廣泛應(yīng)用于各國的動物生產(chǎn)中并取得了顯著的效果[3]。2011年，國家批準(zhǔn)血根堿為二類新獸藥；2012年，以血根堿為主要成分的新型中獸藥類飼料添加劑“美佑壯”也通過了國家批準(zhǔn)。

圖1 血根堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of sanguinarine

2 血根堿提取及分離純化工藝

2.1 血根堿的提取

2.1.1 溶劑提取法

血根堿的提取方法中最常用的是溶劑提取法。目前，對血根堿提取工藝的研究中多以博落回作為提取對象[4]。范家佑等[5]對酸水提取博落回果實(shí)中的血根堿生物堿的工藝進(jìn)行了改進(jìn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在提取溫度90°C、料液比1∶50、提取時(shí)間5 h、pH值為1.5的條件下效果最好，博落回總生物堿的提取率為9.1%。范伏田等[6]采用鹽酸作為溶劑對博落回中生物堿進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)在鹽酸濃度為1.5%、固液比1∶18 g/mL、溫度85°C、提取時(shí)間2 h的條件下提取效率較好，經(jīng)過兩次提取后，博落回總生物堿的提取率為80.1%。曹華亮[7]嘗試了乙醇回流法和酸水滲漉法對博落回莖葉中血根堿進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對乙醇回流法經(jīng)過響應(yīng)面法的優(yōu)化后，當(dāng)乙醇濃度90%、料液比1∶30、硫酸濃度0.12%、提取溫度80℃、提取時(shí)間為2 h的條件下，莖葉中89.36%血根堿均被有效轉(zhuǎn)移。

2.1.2 內(nèi)部沸騰法

內(nèi)部沸騰法是在低溫下強(qiáng)化對植物的提取，相比其他傳統(tǒng)溶劑提取法，內(nèi)部沸騰法優(yōu)點(diǎn)頗多，如提取率高、提取速度快、溶劑用量少等。有關(guān)內(nèi)部沸騰法提取血根堿的工藝的研究表明，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后確定最佳條件，可達(dá)到9.10 mg/g提取率[8-9]。

2.2 血根堿的分離純化

2.2.1 離子交換樹脂法

袁帥[10]采用離子交換樹脂提取博落回中血根堿，結(jié)果顯示，將博落回經(jīng)酸水提取、調(diào)節(jié)至堿性條件后采用氯仿萃取，回收溶劑，得到含45.73%血根堿與白屈菜紅堿的生物堿粗物質(zhì)；再通過層析系統(tǒng)及強(qiáng)陽離子交換樹脂精制，洗脫并收集血根堿餾分，可得到高純度的血根堿提取物，純度達(dá)90%以上。鄧霖芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，采用軟膠型弱陽離子交換樹脂，經(jīng)反相C18制備柱脫鹽及進(jìn)一步純化，得到的血根堿純度可達(dá)97%。

2.2.2 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂法能夠從中草藥成分中選擇性地吸取有效成分。黃敬[12]和黃金紅等[13]對博落回和小果博落回果實(shí)中的總生物堿進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同型號的大孔吸附樹脂提取純化率存在較大差異，AD-8型樹脂為最佳型號，對血根堿等生物堿具有較高的吸附率和洗脫率，在最優(yōu)工藝條件下可得到純度90%以上的博落回總生物堿提取物。

2.2.3 高速逆流色譜法

賈長青等[14]建立了一種利用高速逆流色譜法分離制備血根堿的方法，該法具備使用方便、成本低、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)；在優(yōu)選條件下，能夠從粗制博落回生物堿中分離出50.5%的高純度血根堿鹽酸鹽。

3 血根堿的生物學(xué)功能

3.1 抗菌作用

血根堿的抗菌作用主要有兩種途徑：血根堿能夠抑制細(xì)菌分裂，阻止細(xì)菌Z環(huán)形成，并對絲狀溫度敏感蛋白FtsZ的裝配產(chǎn)生干擾；血根堿還能夠誘導(dǎo)膜結(jié)合細(xì)胞壁自溶酶釋放，使細(xì)菌自身發(fā)生溶解[15]。王靜慧等[16]在體外研究了血根堿的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)血根堿能夠有效地清除病原菌的生物被膜，進(jìn)而抑制病原菌生長繁殖。研究表明，血根堿對多種有害菌均具有抑制效果，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等[17-18]，為解決水產(chǎn)動物生產(chǎn)中的有害菌問題提供了思路。

3.2 抗寄生蟲作用

血根堿具有良好的抗寄生蟲作用。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對指環(huán)蟲的殺蟲效果顯著，0.37 mg/L濃度的血根堿即可殺滅鯽魚魚體內(nèi)半數(shù)的指環(huán)蟲；濃度為0.70 mg/L時(shí)可完全殺滅魚體內(nèi)指環(huán)蟲，與蘆程[20]研究結(jié)果一致，其殺滅寄生蟲的機(jī)制是血根堿對指環(huán)蟲體表結(jié)構(gòu)和抗氧化酶系統(tǒng)造成了一定破壞，同時(shí)也提升了魚體的免疫能力。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，血根堿能夠有效防治血吸蟲，3.68μg/mL濃度的血根堿可完全殺滅血吸蟲。Huang等[22]在針對抗旋毛蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，血根堿可使機(jī)體腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及活性氧自由基含量增加，進(jìn)而達(dá)到加快蟲體的排出的效果。

3.3 抗炎功能

當(dāng)動物機(jī)體面臨外界刺激，其自身的免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生一定的防御性反應(yīng)，即產(chǎn)生了炎癥。血根堿抗炎作用的機(jī)制是由于對核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）產(chǎn)生了抑制，導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)下調(diào)。NF-κB能夠調(diào)控200個(gè)以上基因的表達(dá)，許多炎癥引起的疾病均與NF-κB的活性密切相關(guān)[23]。NF-κB在通常情況下以一種異質(zhì)三聯(lián)體的復(fù)合物形式存在，包括p50、p65、IκB-α，活性較為穩(wěn)定。當(dāng)外界刺激激活NF-κB時(shí)，其中的IκB-α發(fā)生磷酸化、泛素化，最后降解，并將p50-p65異質(zhì)二聚體從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，影響炎癥相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致炎癥因子的上調(diào)及機(jī)體產(chǎn)生炎癥。血根堿可對NF-κB的活化途徑產(chǎn)生抑制，減輕動物機(jī)體的炎癥[24]。Khadem等[25]對鼠進(jìn)行了體外試驗(yàn)，采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，結(jié)果表明，以血根堿為主要功能成分的博落回提取物抗炎作用與抗生素相似。Kantas等[26]在斷奶仔豬日糧中添加了含血根堿的飼料添加劑，發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬的血清中的炎癥指標(biāo)顯著下降。

3.4 抗氧化功能

需氧生物可產(chǎn)生一種活性氧自由基（ROS），當(dāng)機(jī)體處于穩(wěn)定狀況下，ROS含量會保持動態(tài)平衡，促進(jìn)細(xì)胞及組織的生長發(fā)育。適量的ROS能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分裂，而過量的ROS則會抑制細(xì)胞正常生長，引起機(jī)體多種氧化損傷，誘發(fā)多種疾病，持續(xù)的DNA損傷甚至?xí)?dǎo)致癌癥產(chǎn)生[27-29]。研究表明，以血根堿為代表的一些天然抗氧化劑可減緩過量的ROS對機(jī)體造成的負(fù)面作用，能夠清除ROS，還可以避免蛋白質(zhì)氧化損傷和羰基化損傷，抑制脂質(zhì)及DNA氧化損傷[30-33]。Varga等[34]研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對佛波醇誘導(dǎo)的氧化裂解有抑制作用，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶復(fù)合物在此過程中起到重要作用。血根堿的抗氧化機(jī)制可能是對NADPH氧化酶的活性產(chǎn)生抑制，Qin等[35]在研究中也得到了相似的結(jié)果。Liu等[36]采用血管緊張素（an-giotensinⅡ，AngⅡ）構(gòu)建了過量的ROS模型，并研究了血根堿對該模型的作用；結(jié)果表明，機(jī)體中ROS顯著降低，可能是由于血根堿抑制了NADPH氧化酶活性所致。

3.5 保護(hù)肝臟

以血根堿為主要功能成分的博落回提取物（MEC）對急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，能夠提高機(jī)體免疫力，提高B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的免疫性能。此外，MEC還可對肝臟纖維化進(jìn)程產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)肝臟的效果，表現(xiàn)為血清乳酸脫氫酶（LDH）降低及白蛋白/球蛋白（A/G）比值升高。有研究采用血吸蟲構(gòu)建了小鼠肝臟的纖維化模型，結(jié)果表明，MEC顯著改善了小鼠肝臟功能，猜測可能存在多方面原因，如對肝細(xì)胞膜的保護(hù)、抗氧化能力的提高、肝臟炎癥的減輕等[37-38]，與楊軍衡等[39]結(jié)論一致。

3.6 改善腸道健康

腸道健康與機(jī)體的多種功能密切相關(guān)，腸道能夠調(diào)控機(jī)體的營養(yǎng)代謝及免疫功能，影響動物的生長發(fā)育和健康水平。腸道健康程度可從多個(gè)方面判斷，包括對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、腸道屏障功能、腸道微生物及腸道免疫功能等。已有諸多試驗(yàn)證明，以血根堿為主要功能成分的博落回提取物具有多種改善腸道健康的作用：強(qiáng)化對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，表現(xiàn)為促進(jìn)小腸絨毛發(fā)育，增加腸絨毛表面積；促進(jìn)腸道黏膜屏障，腸道緊密連接蛋白表達(dá)水平上升；調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，抑制大腸桿菌等有害菌生長繁殖；提高腸道免疫功能，表現(xiàn)為小腸黏膜免疫球蛋白水平升高[40-42]。

3.7 抗癌

血根堿的抗癌作用表現(xiàn)為對癌細(xì)胞生長上的抑制及對其凋零的誘導(dǎo)，作用機(jī)制主要包括：使癌細(xì)胞產(chǎn)生了游離氧自由基及引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激，對磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及蛋白激酶B（Akt）兩條信號通路產(chǎn)生抑制，使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[43-45]。張鴻[46]研究了血根堿對人體癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)血根堿對人胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且抑制作用與血根堿的濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對前列腺癌細(xì)胞也具有一定的抑制性，表現(xiàn)為DNA損傷增加、細(xì)胞凋亡改變，誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p21Waf1/Cip1和p27Kip1生成，但其抑制效果與劑量密切相關(guān)[47]。此外，血根堿能夠干擾微管的組裝進(jìn)而阻礙癌細(xì)胞增殖，起到抑制宮頸癌的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，過量的促分裂原活化蛋白激酶（MKP-1）對由DNA斷裂劑和細(xì)胞應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，血根堿能夠抑制MKP-1的活性，使癌細(xì)胞不再受MKP-1的保護(hù)而凋亡，進(jìn)而起到一定的抗癌作用[48-49]。

3.8 對生殖系統(tǒng)的作用

Bianco等[50]研究表明，血根堿對雌二醇的生成具有一定程度的抑制作用，但對黃體酮的生成和卵泡細(xì)胞增殖影響較??；血根堿對卵巢顆粒細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）產(chǎn)生存在抑制作用，在一定程度上提升了抗氧化能力。Chan[51]研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對鼠生殖系統(tǒng)存在一定的抑制作用，表現(xiàn)為鼠囊胚細(xì)胞的發(fā)生凋亡，胚胎著床受阻，抑制卵母細(xì)胞成熟，影響胚胎的正常發(fā)育。陶霖等[52]研究發(fā)現(xiàn)，在對患有輸卵管炎癥的蛋雞投喂低劑量血根堿藥餌后，蛋雞病癥得到了顯著改善。綜上所述，血根堿對動物的生殖系統(tǒng)發(fā)育具有一定的負(fù)面作用，在利用血根堿多種優(yōu)良功能的同時(shí)，也不可忽視其存在的不良影響。

4 血根堿在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用

4.1 促進(jìn)生長發(fā)育

Korkut等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在餌料中添加50 mg/kg以血根堿和白屈菜紅堿為主要功能成分的餌料添加劑能夠顯著提高鱸魚的生長性能。Rawling等[54]在紅羅非魚餌料中添加了血根堿及白屈菜紅堿，結(jié)果顯示，血根堿及白屈菜紅堿處理組的紅羅非魚生長性能顯著增加，包括攝食量、增重率、特定生長率等指標(biāo)，而體組成和肝臟功能與對照組相比差異不顯著。

4.2 提高肌肉品質(zhì)

羅來婷等[55]、陳貞年等[56]在中華鱉餌料中分別添加了0、50、100、150mg/kg的血根堿制劑，飼養(yǎng)75 d后對中華鱉的生長性能、免疫能力及肌肉品質(zhì)等指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，血根堿顯著提高了中華鱉存活率和機(jī)體抗氧化能力，改善了肌肉品質(zhì)，優(yōu)化了腸道菌群結(jié)構(gòu)，并對肝臟起到一定保護(hù)作用。在添加50mg/kg血根堿的處理組中，中華鱉肌肉中總氨基酸及鮮味氨基酸的含量均具有一定程度的提高。綜合各項(xiàng)指標(biāo)可知，中華鱉餌料中的最適添加量為50～100 mg/kg。

4.3 改善健康及增強(qiáng)抗病能力

Zhang等[57]研究了血根堿對錦鯉免疫能力、消化性能及腸道微生物組成的影響，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組錦鯉血液中非特異性免疫及抗氧化指標(biāo)顯著上升，腸道腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1（IL-1β）的基因表達(dá)水平顯著降低，腸道微生物的豐富度顯著增加。此外，采用嗜水氣單胞菌對錦鯉進(jìn)行攻毒后發(fā)現(xiàn)，血根堿組的錦鯉存活率明顯上升，說明血根堿能夠在一定程度上提高錦鯉對嗜水氣單胞菌的抗病力。

Imanpoor等[58]研究發(fā)現(xiàn)，在餌料中添加博落回散（主要功能成分為血根堿和白屈菜紅堿）后，鯉魚的增重率和特定生長等生長指標(biāo)均顯著提升，腸道微生物中大腸桿菌等有害菌數(shù)量顯著降低；以嗜水氣單胞菌對鯉魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后，餌料中添加了博落回散的鯉魚存活率顯著高于對照組。

陳團(tuán)[59]分別在草魚高棉粕菜粕餌料和低蛋白餌料中添加了0、200、400、800 mg/kg血根堿，對草魚生長性能、免疫水平、腸道結(jié)構(gòu)及微生物多樣性的影響進(jìn)行了研究；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高棉粕餌料中添加了800 mg/kg血根堿的試驗(yàn)組草魚生長性能、消化能力及肌肉品質(zhì)均顯著提高，MnSOD、IL-1、occludin基因表達(dá)水平顯著上升；腸道絨毛高度及隱窩深度增加，腸道消化吸收能力增強(qiáng)，腸道微菌群結(jié)構(gòu)得到改善。

Zhang等[60]研究表明，血根堿可提高鯽魚機(jī)體的免疫及抗病能力，體現(xiàn)為鰓、腎、脾臟等組織中的多個(gè)白細(xì)胞介素及腫瘤壞死因子表達(dá)水平顯著下調(diào)，趨化因子-1（CCL-1）在魚鰓中的表達(dá)下降，在腎和脾臟表達(dá)上升，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的表達(dá)水平顯著上升。Bussabong等[61]研究發(fā)現(xiàn)，富含血根堿的博落回提取物顯著增強(qiáng)了試驗(yàn)對蝦的抗炎和抗菌活性，提升對蝦機(jī)體的健康度和成活率。石勇等[62]在黃鱔餌料中添加750μg/kg血根堿，投喂8 w后通過腹腔注射脂多糖（LPS）誘導(dǎo)黃鱔產(chǎn)生免疫應(yīng)激及炎癥反應(yīng)；結(jié)果表明，血根堿能夠有效抑制由LPS誘導(dǎo)的多種負(fù)面作用，改善機(jī)體健康。

綜上所述，血根堿在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能夠起到許多積極作用，如殺滅寄生蟲、促進(jìn)生長、促進(jìn)消化吸收、改善肉質(zhì)、提高免疫抗病能力、改善免疫應(yīng)激及炎癥等，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展中前景廣闊[63]。

5 結(jié)論

隨著水產(chǎn)飼用端禁抗和替抗工作的進(jìn)行，血根堿等中草藥受到了學(xué)術(shù)界和市場的一致青睞。血根堿除具有抗炎抗菌的作用外，還具有許多抗生素所不具備的功能，如促進(jìn)攝食、提升肌肉品質(zhì)、保護(hù)肝腸等，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍存在諸多問題，應(yīng)重視基礎(chǔ)研究，進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，加快推進(jìn)血根堿等中草藥的科學(xué)應(yīng)用，促進(jìn)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。