宋淑英

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110064）

奶牛隱性乳房炎（diary cow subclinical mastitis）是奶牛養(yǎng)殖過程中的常見疾病[1-3]。奶牛隱性乳房炎無明顯臨床癥狀，發(fā)病隱蔽不易察覺，但此時乳區(qū)內(nèi)體細(xì)胞數(shù)已明顯升高，對乳品質(zhì)和產(chǎn)量影響巨大，是制約乳產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一[4-9]。隱性乳房炎病因眾多，機械刺激、遺傳因素、營養(yǎng)因素均可誘發(fā)該病，其中，病原微生物感染是最主要的病因之一[10-11]。目前，針對病原菌感染使用抗生素仍是獸醫(yī)臨床治療奶牛隱性乳房炎的首選方法，但隨著抗菌藥物不斷使用，病原菌耐藥性也逐漸增強，不僅加大了疾病治療難度，也增加了動物性食品抗生素殘留的風(fēng)險[12-13]。本研究對撫順某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場隱性乳房炎患病情況進行流行病學(xué)調(diào)查，同時對其主要病原菌進行分離鑒定，評估病原菌分離株的耐藥性水平，為該場奶牛隱性乳房炎治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

試驗于撫順某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場進行樣品采集，選取臨床表現(xiàn)正常、乳區(qū)泌乳功能良好、乳汁性狀正常的泌乳期奶牛600頭。

1.1.2 主要儀器

LS-35LD立式蒸汽高壓滅菌器（上海力辰儀器科技有限公司）、HSP80B恒溫振蕩生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SDD-60KD恒溫隔水式培養(yǎng)箱（紹興蘇珀一起有限公司）、SJ-3084S無菌工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、200μL F3移液器（北京賽默飛世爾科技）。

1.1.3 主要試劑

普通固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂粉，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；高鹽甘露醇培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（20種）購自杭州微生物試劑有限公司；奶牛隱性乳房炎檢測液（蘭州利拉伐CMT套裝）由飼養(yǎng)場提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 隱性乳房炎篩查

采樣奶牛適當(dāng)保定，對4個乳區(qū)進行碘酊-酒精-碘酊的消毒步驟。每個乳區(qū)棄去頭3把奶，分別擠5～10 mL乳樣至CMT檢測搖盤。每個搖盤中分別加入等量的CMT檢測液，水平方向輕搖3～5圈后靜置，觀察顏色變化。采集隱性乳房炎乳區(qū)的乳樣10～15 mL于滅菌離心管，標(biāo)記好的離心管置于4℃樣品冷藏保存盒，盡快送至實驗室。

1.2.2 病原菌初步分離

按照產(chǎn)品說明書要求，配制普通固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基。將配制好的培養(yǎng)基經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜檢菌，檢菌合格的培養(yǎng)基4℃密封保存。

取100μL隱性乳房炎乳樣，均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，正置于無菌工作臺中片刻，待乳樣充分吸收后倒置，37℃恒溫培養(yǎng)12 h。在培養(yǎng)后的瓊脂平板中挑取菌落形態(tài)、生長形狀不同的單獨菌落，分別接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃180 r/min培養(yǎng)12 h，標(biāo)記后于終濃度為30%的甘油中-80℃保存、待檢。

取待檢甘油菌，分別涂布于麥康凱瓊脂平板和高鹽甘露醇瓊脂平板中，同普通瓊脂平板培養(yǎng)條件，對病原菌進行初步分離[10]。

1.2.3 病原菌生化反應(yīng)鑒定

在麥康凱瓊脂平板中選取圓形、具有紅色金屬光澤的典型菌落；在高鹽甘露醇瓊脂平板中選取圓形、淡黃色、菌落周圍呈明顯黃色的針尖狀菌落，分別采用腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管和葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管，對其進行生化反應(yīng)鑒定。將細(xì)菌接種于微量鑒定管后，加入1滴液體石蠟封閉鑒定管，37℃恒溫封口培養(yǎng)過夜。觀察反應(yīng)管顏色變化，并根據(jù)細(xì)菌編碼手冊對病原菌進行賦碼、鑒定。

1.2.4 病原分離株藥敏試驗

將鑒定后的主要病原菌分離株均勻涂布于90 mm固體瓊脂平皿中，待菌液吸收后將藥敏紙片均勻放置于平皿內(nèi)，藥敏紙片間預(yù)留足夠距離以便測量抑菌環(huán)直徑。平皿37℃恒溫培養(yǎng)12 h，游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑，取3次測量結(jié)果的平均值為該藥物對病原菌分離株的抑菌直徑，并與參考值進行比較，評估病原分離株對藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 隱性乳房炎篩查結(jié)果

在該場調(diào)查的600頭奶牛2 400個乳區(qū)中，發(fā)現(xiàn)28頭為隱性乳房炎陽性病牛，患病乳區(qū)47個。該場奶牛隱性乳房炎患病率為4.67%，乳區(qū)陽性率為1.96%。

2.2 隱性乳房炎病原菌分離鑒定結(jié)果（見圖1）

圖1 隱性乳房炎病原菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 Pathogenic bacteria isolation and identification result of subclinical mastitis

由圖1可知，陽性病料經(jīng)麥康凱及高鹽甘露醇鑒別培養(yǎng)基，初步分離到疑似腸桿菌科分離株56株、葡萄球菌屬分離株63株。上述病原菌分離株經(jīng)生化反應(yīng)鑒定、編碼對比，最終確定病原菌76株，其中大腸桿菌分離株31株、金黃色葡萄球菌38株、表皮葡萄球菌6株、腐生葡萄球菌1株。該場奶牛隱性乳房炎主要病原菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，占比分別為50%（38/76）及40.8%（31/76）。

2.3 隱性乳房炎主要病原菌耐藥性結(jié)果（見表1）

對本試驗分離到的38株金黃色葡萄球菌及31株大腸桿菌分離株進行藥敏紙片抑菌試驗，結(jié)果表明，2種病原菌對受試的臨床常用20種抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。

由表1可知，金黃色葡萄球菌分離株對磺胺類藥物的復(fù)方新諾明和磺胺甲基異惡唑耐藥率較高，分別為71.1%及57.9%；其他耐藥率相對較高的藥物為慶大霉素、四環(huán)素及鏈霉素，耐藥率分別為52.6%、47.4%及44.7%。金黃色葡萄球菌對頭孢菌素類及青霉素類藥物敏感性相對較高，尤其是頭孢菌素類，頭孢拉定和頭孢曲松各僅有1株（2.6%）分離株對其耐藥。

表1 隱性乳房炎主要病原菌耐藥性結(jié)果Tab.1 Antibiotics resistance result of major pathogenic bacteria isolated from subclinical mastitis

在31株大腸桿菌分離株中，絕大多數(shù)分離株對受試藥物均表現(xiàn)較高的耐藥性，如對復(fù)方新諾明、磺胺甲基異惡唑、卡那霉素、青霉素及紅霉素均表現(xiàn)高度耐藥，耐藥率分別為90.3%（28/31）、96.8%（30/31）、87.1%（27/31）、80.6%（25/31）及80.6%（25/31）。大腸桿菌僅對頭孢菌素類藥物敏感，對頭孢拉定及頭孢曲松敏感率為67.7%（21/31）及64.5%（20/31）。

對病原菌分離株進行多藥耐藥分析，結(jié)果顯示，65.8%（25/38）的金黃色葡萄球菌及77.4%（24/31）的大腸桿菌分離株為多藥耐藥菌株（同時耐受至少3類抗菌藥物）。在金黃色葡萄球菌中，同時耐受4類藥物的分離株占比最高，為42.1%（16/38）；在大腸桿菌中，同時耐受5類藥物的分離株占比最高，為35.5%（11/31）。在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中均有分離株耐受所有種類受試藥物。

3 討論

奶牛隱性乳房炎具有隱蔽性強、流行范圍廣的特點，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)及乳產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前，抗生素療法是臨床治療隱性乳房炎的首選方案，但隨著藥物的不斷使用，病原菌在抗生素的選擇壓力作用下逐漸產(chǎn)生耐藥性，給臨床疾病治療和動物性食品安全帶來挑戰(zhàn)。因此，對奶牛隱性乳房炎展開流行病學(xué)調(diào)查及病原耐藥性研究意義重大。

本研究對遼寧撫順某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場進行隱性乳房炎病原耐藥性研究，結(jié)果表明，該場奶牛隱性型乳房炎患病率為4.67%、乳區(qū)陽性率為1.96%，與其他地區(qū)報道數(shù)據(jù)相比患病率相對較低。

王勇民[7]報道，河南地區(qū)規(guī)模化和散養(yǎng)戶奶牛隱性乳房炎發(fā)病率分別為45.3%和57.1%。呂倩等[8]報道，四川地區(qū)奶牛隱性乳房炎總發(fā)陽性率為19.0%。韓曉霞等[9]報道，陜西地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場隱性乳房炎發(fā)病率為10.6%。馬博等[2]報道，新疆地區(qū)隨機抽樣檢測奶牛隱性乳房炎患病率為24%。劉霄等[11]報道，昆明地區(qū)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場隱性乳房炎陽性率為28.79%、散養(yǎng)戶陽性率為56.21%。李艷菊等[13]報道，天山北坡奶牛隱性乳房炎總體患病率為21.0%，且高產(chǎn)奶牛發(fā)病率顯著低于低產(chǎn)奶牛。楊興斌[14]報道，甘肅地區(qū)奶牛隱性乳房炎患病率為49.17%，且陰性乳房炎患病率與奶牛胎次呈明顯正相關(guān)。與報道數(shù)據(jù)相比，本研究中奶牛養(yǎng)殖場隱性乳房炎陽性率相對較低，可能與該場日常飼養(yǎng)管理因素有關(guān)。養(yǎng)殖場能夠經(jīng)常對奶牛進行體細(xì)胞計數(shù)檢測、CMT日常篩查等，可盡早發(fā)現(xiàn)陽性病例并進行積極干預(yù)。

本研究對分離到的主要病原菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）進行藥物敏感性測試。結(jié)果表明，兩種病原菌分離株對磺胺類藥物均表現(xiàn)較高的耐藥性，對其他受試藥物也表現(xiàn)出不同程度的耐受；兩種病原菌分離株均對頭孢菌素類藥物較為敏感。

馬博等[2]報道，新疆地區(qū)陰性乳房炎金黃色葡萄球菌對青霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星耐藥率為100%，對阿莫西林耐藥率為80.8%、對慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐耐藥率為5.7%，對多西環(huán)素、克林霉素、四環(huán)素耐藥率為0。鄧凱偉等[4]報道，信陽地區(qū)隱性乳房炎大腸桿菌對萬古霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因高度敏感，對紅霉素中度敏感，對克林霉素、克拉霉素、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明低度敏感，對大觀霉素、四環(huán)素、青霉素G、苯唑西林、多黏菌素B耐藥。李希強等[15]報道，內(nèi)蒙古地區(qū)隱性乳房炎金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對慶大霉素、美羅培南、環(huán)丙沙星、磷霉素敏感，對四環(huán)素、頭孢他啶、氟苯尼考耐藥性較高。本研究結(jié)果與上述結(jié)論中耐藥性、耐藥譜等方面存在差異，可能是由于地理位置及日常治療用藥方案等不同所致。

4 結(jié)論

對病原菌分離株多藥耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)，本研究得到的分離株均表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的多藥耐藥現(xiàn)象，42.1%的金黃色葡萄球菌同時耐受4類藥物，35.5%的大腸桿菌同時耐受5類藥物。耐藥性菌株，特別是多藥耐藥菌株的大量存在，可對疾病治療及預(yù)防造成嚴(yán)重威脅。建議該場根據(jù)研究結(jié)果合理制定治療方案。