李孟純，段嘉寶，鄧文卓，楊具田，李 鈾，2，3*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730100；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅蘭州 730030）

我國綿羊經(jīng)目的性培育逐漸形成了適應(yīng)性強且抗病、抗逆性強的品種[1]。因長期進行品種間雜交以及不斷引進外來優(yōu)勢品種，許多地方特有的綿羊品種數(shù)量減少甚至瀕臨消失[2]。蘭州大尾羊生長發(fā)育快、肉質(zhì)豐滿、耐粗飼，以尾部粗大、脂肪沉積多聞名[3]，滅絕頻率為0.77，被國家列為瀕臨滅絕的遺傳資源[4-5]。灘羊是優(yōu)良裘皮用綿羊品種，但生長發(fā)育速度較慢[6]。藏羊可根據(jù)體型外貌、生產(chǎn)性能、分布地域劃分為不同類群，但目前我國對藏羊系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究相對較少，對其起源等領(lǐng)域不甚了解[7]。小尾寒羊是肉裘兼用型的地方綿羊品種，繁殖、發(fā)育快速且具有較穩(wěn)定的遺傳性能[8]。

線粒體DNA（mtDNA）是動物細胞中唯一存在于細胞核外的遺傳物質(zhì)，結(jié)構(gòu)簡單、進化快速且提取方便，廣泛應(yīng)用于家畜種及品種的起源、演化和分類的研究[9-10]。在mtDNA的編碼基因中，細胞色素b（Cytb）基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究較清晰。Cytb基因的進化速率適中，包含從種內(nèi)到種間的較強進化信號，故多采用Cytb基因研究物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[11]。COX1基因變異速率適中，可避免堿基替換飽和的問題，適用于種群遺傳多樣性的分析[12]。本研究基于線粒體Cytb與COX1基因分析甘肅地區(qū)的綿羊品種蘭州大尾羊、小尾羊、灘羊和藏羊的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，與國內(nèi)外其他綿羊品種進行比較，為種質(zhì)資源的保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘肅某羊場采取大尾羊、小尾羊、灘羊和藏羊的組織樣本以及GenBank上下載的20個國內(nèi)外綿羊品種的COX1與Cytb基因序列。

1.2 試劑與儀器

2×Pro Taq預(yù)混液（艾科瑞生物）、瓊脂糖（Boisharp）、50×TAE緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 基因組擴增

使用Gentra Puregene extraction kit從動物組織中提取純度較高且分子量大的基因組DNA。參照GenBank已發(fā)表的綿羊COX1與Cytb基因序列設(shè)計引物，由寶生物工程（大連）公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

PCR擴增反應(yīng)體系（25μL）：10 mmol/L上游引物0.5μL、10 mmol/L下游引物0.5μL、50μg/L DNA樣品2μL、5 U/μL PremixTaq（Takara）12.5μL、無菌水9.5μL。

PCR的擴增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，58（54）℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。

將擴增產(chǎn)物放置于含量為1.4%的瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.4 構(gòu)建發(fā)育樹

將成功擴增的4種綿羊的PCR產(chǎn)物送至蘭州天啟生物公司進行序列測定，反饋的測序結(jié)果通過Geneious 11.0.4進行處理原始文件AB1，將上下游的波峰進行拼接獲得較為完整的序列波峰圖，與NCBI上下載的相關(guān)基因完整序列進行進一步的校對，最終獲得單個樣本的完整序列，并與GenBank上下載的國內(nèi)外綿羊品種的COX1和Cytb基因序列對比。

通過MEGA-X進行比對處理，導(dǎo)出Fasta格式，再進行發(fā)育樹的構(gòu)建。GenBank上下載的國內(nèi)外綿羊品種的序列見表2。

表2 GenBank上下載的國內(nèi)外綿羊品種的序列Tab.2 Sequence of sheep breeds downloaded from GenBank

本研究構(gòu)建發(fā)育樹以盤羊為外群，分別采用鄰接法（NJ）構(gòu)建NJ樹和最大似然法（ML）構(gòu)建ML樹。NJ樹采用p-distance法計算遺傳距離，Bootstrap重復(fù)選擇為1 000次；ML樹采用Find Best DNA/Protein Models選取BIC為最低值的相對模型作為最佳模型，Bootstrap重復(fù)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 COX1與Cytb基因的測序結(jié)果

將成功擴增的PCR產(chǎn)物送至蘭州天啟生物科技有限公司測序，并將序列結(jié)果經(jīng)Geneious11.0.4校對，與國內(nèi)外其他綿羊品種的Cytb與COX1基因序列比較。結(jié)果顯示，COX1基因樣品序列為470 bp，Cytb樣品序列為944 bp。

利用MEGA-X軟件的Statistic功能分析的Nucleotide Composition核苷酸組成，結(jié)果顯示，COX1基因中A、T、G、C平均含量分別為29.3%、33.3%、14.5%、22.8%，A+T=62.6%，C+G=37.3%；Cytb基因中A、T、G、C平均含量分別為30.1%、27.1%、13.8%、29%，A+T=57.2%，C+G=42.8%。

此外，在COX1基因中包含：保守位點450個、變異位點20個、簡約變異位點6個、單突變位點14個、未簡并位點306個、2倍簡并位點82個和4倍簡并位點78個；在Cytb基因中包含：保守位點888個、變異位點55個、簡約變異位點16個、單突變位點39個、未簡并位點606個、2倍簡并位點166個和4倍簡并位點158個。

2.2 基于COX 1與Cytb基因的系統(tǒng)發(fā)育分析（見圖1～圖4）

圖4 基于Cytb基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹）Fig.4 Constructing phylogenetic tree based on Cytb(NJ tree)

將最低BIC分數(shù)（貝葉斯信息標準）的模型作為遺傳距離算法模型分析中的最佳模型，經(jīng)MAGA-X的Model得知，COX1基因的BIC最低值對應(yīng)的模型是T92∶Tamura 3-parumeter；Cytb基因的BIC最低值對應(yīng)的模型是HKY∶Hasegawa-Kishino-Yano。

由圖1可知，COX1基因的ML樹分為：圖申羊、奧帕里諾羊等和小部分大尾羊、小尾羊、灘羊和藏羊為一支；烏拉藏羊、巴什貝羊等和大部分大尾羊、小尾羊、灘羊和藏羊為一支，其中灘羊S8、S9、S11、S13、S14、S15和藏羊T2、T10以及大尾羊D1和小尾羊X3、X4親緣關(guān)系較近為一小支。

圖1 基于COX1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（ML樹）Fig.1 Constructing phylogenetic tree based on COX1(ML tree)

由圖2可知，COX1基因的NJ樹分為：圖申羊、奧帕里諾羊等和一小部分大尾羊、小尾羊、灘羊和藏羊為一支；巴什貝羊、葉城羊等和絕大部分的大尾羊、小尾羊、灘羊和藏羊為一支，其中大部分灘羊樣本與其他樣本親緣關(guān)系較近，聚為一小支。

圖2 基于COX1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹）Fig.2 Constructing phylogenetic tree based on COX1(NJ tree)

由圖3可知，Cytb基因的ML樹分為：藏羊T10單獨一支；其他所有羊為一支，其中藏羊T2和小尾羊X3、X4的親緣關(guān)系較近，成為單獨的一小支。

圖3 基于Cytb基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（ML樹）Fig.3 Constructing phylogenetic tree based on Cytb(ML tree)

由圖4可知，Cytb基因的NJ樹與其ML樹大體相同：藏羊T10單獨一支；其他所有羊為一支，其中小尾羊X7和大尾羊D6、D16由于親緣關(guān)系較近成為一小支。

綜上所述，COX1基因的NJ樹和ML樹均為兩大支，大體一致；Cytb基因的NJ樹和ML樹的結(jié)構(gòu)相似，均為藏羊T10單獨成為一支。

3 討論

mtDNA已成為研究真核生物分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子系統(tǒng)進化的重要模式體系[13]。Cytb基因廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)進化關(guān)系的研究，即使基因片段較小，但包含由種內(nèi)到種間甚至科間的遺傳進化信息[14]。細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ的結(jié)構(gòu)具有高度保守的特點，且該基因的核苷酸進化速率較適中，適用于進化分析[15]。地球正面臨著物種滅絕的嚴重威脅，應(yīng)重視對種質(zhì)資源的保護。

本研究通過編碼線粒體內(nèi)膜上細胞色素b氧化酶基因的一個亞基Cytb和線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ對4種綿羊的種質(zhì)及與其他部分綿羊的基因序列比較進行研究；利用PCR擴增技術(shù)，確定最佳反應(yīng)條件，對Cytb和COX1基因進行擴增和PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果進行比對分析并建樹。

根據(jù)建樹結(jié)果可知，在Cytb和COX1基因中均有4種綿羊與其他部分綿羊不同程度的親緣關(guān)系。在COX1基因中，NJ樹和ML樹中除外群分為一支，再另分為兩支，且均包括灘羊、藏羊、大尾羊和小尾羊的樣本，說明4種綿羊與除盤羊外的19種綿羊均有親緣關(guān)系，即其間存在基因流。在Cytb基因，NJ樹和ML樹除外群盤羊外，分為兩大支，一支為藏羊T10的樹，其余羊為一大支，說明藏羊T10與盤羊親緣關(guān)系近，與其他綿羊的親緣關(guān)系相比較遠。在Cytb基因和COX1基因中的ML樹和NJ樹中出現(xiàn)4種綿羊聚為一支的現(xiàn)象，說明采取的綿羊樣本中存在基因流?；蛄鲿p少種群間的遺傳差異，其強弱與程度也因種群與環(huán)境不同存在很大差異。綿羊間出現(xiàn)基因流導(dǎo)致原始品種資源減少，保護綿羊種質(zhì)資源迫在眉睫。

4 結(jié)論

研究表明，對甘肅地區(qū)4種綿羊的種質(zhì)資源保護需要避免與其他物種間的基因流。地方特有綿羊品種數(shù)量減少甚至瀕臨滅絕，在后續(xù)研究中應(yīng)采取多基因，更全面地分析系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，對研究甘肅地區(qū)的綿羊品種起源以及對綿羊品種的保護和利用具有一定意義。