李夢(mèng)雨，董 紅，范洪先，鄭新寶，張永生，李超程，孫玉江，賈 斌*

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆烏魯木齊 830000；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

近年來，我國驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，驢已由役用向藥、肉、乳、保健美容及生物制品等多產(chǎn)業(yè)方向發(fā)展并呈良好勢(shì)頭[1]。因機(jī)械化在農(nóng)業(yè)和交通運(yùn)輸中的快速普及和城鎮(zhèn)化水平提高，驢的役用功能被機(jī)械取代，飼養(yǎng)量越來越少。我國驢存欄量從1991年的1 120萬頭下降至2018年的253.3萬頭[2]。新疆驢是南疆地區(qū)經(jīng)精心培育的優(yōu)良驢品種，具有繁殖力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼等特性。

人工授精是提高新疆驢群體數(shù)量的重要技術(shù)手段，在驢的品種改良中起到重要作用。驢人工授精技術(shù)一般可分為：采集鮮精加入精液稀釋液，分裝直接輸精；冷凍精液人工授精技術(shù)，即采集鮮精后經(jīng)處理先冷藏再冷凍，使用時(shí)解凍再進(jìn)行輸精。冷凍精液便于運(yùn)輸，使用冷凍精液輸精可最大限度地提高種公驢精液的利用率，使異地配種成為現(xiàn)實(shí)，有益于地方品種改良[3]。精液冷凍保存實(shí)現(xiàn)了低成本保存種質(zhì)資源，促進(jìn)了種質(zhì)資源的利用[4]。目前，適用于新疆驢的低成本、高效精液冷凍技術(shù)的相關(guān)研究較少，故生產(chǎn)集約化的冷凍精液迫在眉睫[5]。本研究通過對(duì)比4種精液冷凍保存液，篩選出成本低且可高效利用的精液冷凍保存液，探索適合新疆驢精液冷凍的條件，為提高新疆驢精液冷凍技術(shù)、經(jīng)濟(jì)效益和品種保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為新疆喀什市澤普縣新疆金胡楊藥業(yè)有限公司提供的4頭成年種公驢。種公驢的飼養(yǎng)管理根據(jù)GB/T 1.1—2020規(guī)范起草的《種公驢飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行飼喂。采用單圈飼養(yǎng)，選擇有充足的陽光及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)所，自由飲水、自由采食。

1.2 主要試劑

精液冷凍保存稀釋液選用INRA-Freeze（IMV公司）、Optidyl（IMV公司）、房氏驢精液冷凍保存液[6]、馬精液冷凍保存液[7]等4種。

1.3 主要儀器

假陰道（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)馬研究中心）；恒溫水浴鍋、恒溫冰箱、離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；0.5 mL細(xì)管（法國卡蘇公司）；可調(diào)式微量移液器（Eppendorf公司）；顯微鏡（Olympus）；載玻片、蓋玻片、湯麥?zhǔn)涎蛴?jì)數(shù)板（上海化科學(xué)器材有限公司）；獸用精液過濾紙（世博畜牧設(shè)備有限公司）；Minitube SDM6 Peinter精液密度測(cè)定儀（北京布拉德科技發(fā)展有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 精液的采集及預(yù)處理

采用假陰道法采集種公驢精液，過濾后置于量筒內(nèi)，記錄每頭驢的精液量；制作精子涂片，采用10級(jí)評(píng)分法檢測(cè)精子活力，新鮮原精活力一般為0.7～0.8左右，冷凍保存精液精子活力應(yīng)在0.3級(jí)以上[8]。50μL原精液加生理鹽水稀釋20倍混勻，吸入0.2 mL稀釋后的精液樣品滴至蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)池，靜置5 min計(jì)數(shù)。遵循“計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左不計(jì)右”的原則，5點(diǎn)取樣法記錄方格中總精子數(shù)，計(jì)算精子密度。

將精子活力≥0.7且密度為2～3億/mL的精液應(yīng)用于細(xì)管冷凍精液的制作[9]。精液預(yù)處理時(shí)添加精液稀釋液按照1∶1～1∶2比例添加[10]，使用600×g離心10 min，除去精清后添加精液冷凍液調(diào)整精子密度至1×108個(gè)/mL。

1.4.2 對(duì)比篩選不同冷凍液對(duì)精子凍后活力的影響

分別采集4頭種公驢精液，每頭種公驢精液等比例分為4組。每組分別標(biāo)記INRA-Freeze、Optidyl、房氏冷凍液、馬精液冷凍液，調(diào)整精液密度至1×108個(gè)/mL。4℃降溫平衡1.5 h，在4℃環(huán)境中裝入0.5 mL/支細(xì)管；將細(xì)管置于細(xì)管架上，倒入10 cm深液氮，待蒸汽消散將細(xì)管架固定于距離液氮面高度2～3 cm處，熏蒸7 min后整體投入液氮，每組取3支細(xì)管37℃水浴30 s，制作精子涂片測(cè)定精子活力。每組重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.4.3 對(duì)比篩選不同降溫時(shí)間對(duì)精子凍后活力的影響

分別采集4頭種公驢精液，每頭種公驢精液等比例分成3組。離心除精清后，使用試驗(yàn)1.4.2中結(jié)果最好的冷凍液INRA-Freeze冷凍液稀釋精液，將精液密度調(diào)整至1×108個(gè)/mL。稀釋好的精液緩慢降溫至4℃，分別采用不同平衡時(shí)間（90、120、150 min）進(jìn)行降溫平衡處理，取10μL滴在38℃的載玻片上，制作精子涂片測(cè)定精子活力。使用1.4.2的液氮熏蒸方法進(jìn)行冷凍并檢測(cè)、記錄精子活力。每組重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.4.4 對(duì)比篩選不同熏蒸時(shí)間對(duì)精子凍后活力的影響

分別采集4頭種公驢精液，每頭種公驢精液等比例分為6組。離心除精清后使用INRA-Freeze冷凍液稀釋精液，精液緩慢降溫至4℃，90 min降溫平衡處理，取10μL滴于38℃的載玻片，制作精子涂片測(cè)定精子活力。

采用1.4.2的液氮熏蒸方法熏蒸時(shí)間分別設(shè)置為5、6、7、8、9、10 min熏蒸后整體投入液氮。每組取3支細(xì)管37℃水浴解凍30 s，制作精子涂片測(cè)定精子活力并記錄。每組重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆驢鮮精理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果（見表1）

采集新疆驢鮮精，編號(hào)并進(jìn)行進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定。由表1可知，編號(hào)005精液密度最高，編號(hào)001精液量最高。

表1 新疆驢鮮精理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination results of physicochemical properties of fresh essence of Xinjiang donkey

2.2 不同精液冷凍液對(duì)驢精子凍后活力的影響（見圖1）

圖1 不同精液冷凍液對(duì)驢精子凍后活力的影響Fig.1 Effect of different semen freezing solutions on motility of donkey sperm after freezing

由圖1可知，使用INRA-Freeze的精子凍后活力最高，顯著高于使用Optidyl冷凍液和馬精液冷凍液的精子凍后活力（P＜0.05）。

2.3 不同降溫平衡時(shí)間對(duì)精子凍后活力的影響（見圖2）

由圖2可知，使用INRA-Freeze冷凍液，在4℃冰箱中平衡90、120、150 min的精子凍后活力差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同熏蒸時(shí)間對(duì)驢精子凍后活力的影響（見圖3）

由圖3可知，使用INRA-Freeze冷凍液，在4℃恒溫冰箱中平衡后放入細(xì)管架熏蒸時(shí)，熏蒸7 min的精子凍后活力顯著高于熏蒸5、9、10 min的精子凍后活力（P＜0.05）。

3 討論

人工授精中使用冷凍精液的受胎率低于使用新鮮精液或冷卻精液。研究表明，在冷凍過程中，溫度、滲透壓的變化或冷凍液和精子細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起的應(yīng)激均對(duì)精子細(xì)胞有害[11]，可影響精子的功能及運(yùn)動(dòng)能力，降低精子細(xì)胞壽命。有研究實(shí)現(xiàn)了利用INRA-Freeze使冷凍精液的受胎率達(dá)到61.5%，表明INRA-Freeze是首選的冷凍液[5,11]。Rota等[12]在比對(duì)INRA和GLY冷凍液后發(fā)現(xiàn)，在添加INRA-Freeze冷凍液的精液中可觀察到直線運(yùn)動(dòng)精子的個(gè)數(shù)更多且速率更高。因此，選用INRA-Freeze冷凍液可將冷凍程序?qū)拥膿p害降至最低。在本研究中，房氏冷凍液可達(dá)到與INRA-Freeze相同的冷凍效果，表明在制作驢的細(xì)管凍精時(shí)，使用INRA-Freeze和房氏冷凍液均可得到較好的結(jié)果。

細(xì)管精液預(yù)處理方案分別為稀釋-離心-再懸浮和離心-再懸浮。兩者差別僅在于鮮精是否進(jìn)行稀釋以及不同稀釋液的選擇對(duì)冷凍液冷凍后是否存在影響。Alvarenga等[13]、Joseph等[5]指出，種公馬的精液在600×g離心10 min時(shí)，精子損失和精子損壞可降至最低。本試驗(yàn)除精清過程選擇上述離心方法以減少離心對(duì)精子的損傷。但要保持精子質(zhì)膜完整性，則需去除離心的步驟[14]。

本試驗(yàn)制作細(xì)管凍精的方法采用新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所的專利《一種驢精液冷凍保存的方法》，此方法在羊、驢等家畜中均有應(yīng)用[15]。Alvarenga等[13]提到4種冷凍方案，其中兩種方案均為先進(jìn)行冷卻處理，一種進(jìn)行中等冷凍（-20℃），另一種則為快速冷凍（液氮熏蒸）；另外兩種方案不進(jìn)行冷卻處理，直接進(jìn)行中等冷凍和快速冷凍。使用先冷卻再冷凍可更好地保持精子膜的完整性，且直線運(yùn)動(dòng)精子的百分比高于直接冷凍的方案。本研究中選擇先冷卻處理再進(jìn)行快速冷凍以提高凍后有效精子數(shù)。

有研究表明，精液降溫平衡的時(shí)間為20 min～4 h[16]，時(shí)間越長(zhǎng)冷凍液的毒性越大。楊秋鳳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，降溫平衡時(shí)間過長(zhǎng)或過短均可降低細(xì)管精液的冷凍效果。本試驗(yàn)中進(jìn)行比對(duì)的時(shí)間段為中間時(shí)段，最終冷凍效果差異不顯著。國內(nèi)研究者指出，液氮熏蒸的時(shí)間一般低于15 min，通常為7～8 min[18-20]；而國外研究者則認(rèn)為液氮熏蒸時(shí)間一般高于15 min[5,11]。本試驗(yàn)最佳液氮熏蒸時(shí)間為6～8 min，與其他國內(nèi)研究者的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)對(duì)新疆驢制作冷凍精液流程中使用冷凍液進(jìn)行評(píng)估，探索了降溫平衡的時(shí)間和液氮熏蒸時(shí)間，總結(jié)出了最適冷凍液和冷凍過程中的降溫以及熏蒸時(shí)間，以期為新疆驢種質(zhì)資源的保護(hù)提供參考。本試驗(yàn)采用手工冷凍檢測(cè)，因季節(jié)性原因未進(jìn)行細(xì)管凍精受胎率試驗(yàn)，故細(xì)管凍精的使用效果仍有待進(jìn)一步試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

4 結(jié)論

在制作新疆驢細(xì)管凍精過程中，使用INRA-Freeze冷凍液稀釋已過濾的驢精液，4℃平衡90 min后裝入0.5 mL的細(xì)管依次擺放于細(xì)管架上，置于液氮熏蒸7 min后可得到精子凍后活力最佳的細(xì)管凍精。