鄧福金，周國權(quán)，王化青

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110064）

冷凍精液人工授精技術(shù)是動物繁殖領(lǐng)域一項重大創(chuàng)新，極大地提高了優(yōu)良種公畜的利用率[1]。冷凍精液人工授精技術(shù)在傳統(tǒng)家畜中已得到普遍應(yīng)用，但在鹿的繁殖領(lǐng)域應(yīng)用程度不高[2]。目前，遼寧省鹿的繁殖方式仍以自然交配為主，人工授精普及率低，母鹿受胎率不高，冷凍精液質(zhì)量差。冷凍精液質(zhì)量與鮮精品質(zhì)、稀釋液種類、稀釋方法、冷凍等因素有關(guān)，其中精液冷凍技術(shù)是影響冷凍后精子活力主要因素。

精子冷凍效果是指精子通過可對細(xì)胞產(chǎn)生致死性傷害的危險溫區(qū)的速度。通過有效地控制降溫速率，達(dá)到最佳冷凍溫度，是決定精液冷凍效果的關(guān)鍵條件之一[3]。精子冷凍后的活力與降溫速率密切相關(guān)。本試驗從冷凍溫度的選擇入手，控制精液降溫速率變化，進(jìn)而找到適宜的精液降溫速率，以達(dá)到提高精子復(fù)蘇率的目的。試驗結(jié)果對于提高優(yōu)良種公鹿利用率、加快良種推廣和種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗精液來自桓仁強(qiáng)風(fēng)鹿業(yè)科研繁育基地，采集自3頭梅花鹿。

1.2 主要儀器

簡易泡沫箱（規(guī)格70 mm×40 mm×40 mm，購自菜市場）、BX41型生物顯微鏡（Olympus）、ACCUREAD型精子密度儀（卡蘇公司）、MCT-200型自動數(shù)字測溫儀（北京宇時技術(shù)開發(fā)公司）

細(xì)管0.25 mL、稀釋液Bioxcell購自法國IMV卡蘇公司；封口粉、托架購自沈陽富士平生物技術(shù)有限公司；250μL移液器購自湖南力辰儀器科技有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

試驗分為A、B、C、D、E、F等6組，對應(yīng)液氮面與冷凍面之間的距離分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 cm。每組同時冷凍3頭鹿的精液，每頭鹿3支細(xì)管含有精液，其他以稀釋液代替。

將測溫儀探頭插入一支含有精液的細(xì)管中固定，測定冷凍過程中精液溫度的變化。另一臺測溫儀探頭固定在托架上細(xì)管精液所在冷凍面位置，測定冷凍過程中冷凍溫度的變化，測溫儀自動記錄間隔時間設(shè)置為10 s。

根據(jù)精液在每組降溫速率和精子復(fù)蘇率，找出精液適宜冷凍溫度范圍，根據(jù)測溫儀記錄的數(shù)據(jù)繪制出精液降溫變化曲線。

1.4 測定指標(biāo)及方法

泡沫箱倒入液氮后，調(diào)整液氮面與冷凍面間的距離，測定對應(yīng)距離冷凍面的溫度，即精液的初凍溫度[4-5]。將已碼放好細(xì)管精液的托架放入泡沫箱內(nèi)，以液氮蒸氣逐漸使其降溫凍結(jié)約10～15 min，使細(xì)管精液遵循一定的降溫曲線[6]。當(dāng)細(xì)管內(nèi)精液溫度降至-130℃以下并維持一定時間后，即可直接投入液氮，測溫儀按照預(yù)先設(shè)定的程序自動記錄每一時刻的溫度。

1.4.1 精液采集

按照DB22/T 2599—2016梅花鹿精液采集及冷凍技術(shù)規(guī)程進(jìn)行[7]。

1.4.2 精液生產(chǎn)

判定精子活力、測定精液密度、測量采精量；根據(jù)活力、密度、采精量和每支細(xì)管精液應(yīng)含有的有效精子數(shù)量，采用稀釋液對精液進(jìn)行一次性稀釋；精液稀釋后室溫靜置10 min，采用移液器分裝至細(xì)管，以封口粉封口；分裝后的細(xì)管精液放入4～5℃低溫柜中降溫平衡3～4 h；細(xì)管精液于4～5℃碼簾上架，待冷凍。

1.4.3 凍精活力評定

精液解凍后，于載有37℃恒溫板的顯微鏡下檢查活力，精子活力評定按照梅花鹿冷凍精液DB22/T 2611—2017進(jìn)行[8]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行初步處理，Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間差異采用獨立樣本t測驗比較，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 初凍溫度對精液降溫速率的影響（見表1）

表1 初凍溫度對精液降溫速率的影響Tab.1 Effect of initial freezing temperature on the rate of semen cooling

由表1可知，精液降溫速率由高到低為A組＞B組＞C組＞D組＞E組＞F組。其中A組降溫速率最高，為57.6℃/min，顯著高于其他各組（P＜0.05）；B、C組顯著高于D、E、F組（P＜0.05），但組間差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，初凍溫度與精液降溫速率密切相關(guān)。

2.2 精液冷凍過程中降溫曲線的變化（見圖1）

由圖1可知，當(dāng)精液和冷凍面接觸后溫度迅速下降，冷凍面溫度隨之急劇上升；當(dāng)精液下降溫度和冷凍面上升溫度達(dá)到一致時，即熱平衡溫度；隨后精液溫度隨著冷凍溫度的變化而急劇下降，當(dāng)精液溫度達(dá)到-130℃以下時進(jìn)入玻璃化狀態(tài)[9]。

圖1 精液冷凍過程中降溫曲線的變化Fig.1 Change of cooling curve during semen freezing

結(jié)果表明，初凍溫度影響精液溫度下降速率和溫度回升的幅度，可得出鹿細(xì)管冷凍精液初凍溫度變化規(guī)律。精液降溫速率和冷凍溫度回升的幅度受初凍溫度的影響，初凍溫度越低，精液降溫速率越快，溫度回升幅度越低；初凍溫度越高，精液降溫速度越慢，溫度回升幅度越高。精液冷凍從開始5℃至冷凍結(jié)束-130℃所經(jīng)歷的過程，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3個溫區(qū)，不同溫區(qū)精液降溫速率不同。

2.3 初凍溫度對精子復(fù)蘇率的影響（見表2）

由表2可知，初凍溫度由高到低為A組＞B組＞C組＞D組＞E組＞F組，冷凍后精子活力由高到低為C組＞B組＞D組＞E組＞A組＞F組。其中C組凍精活力最高，為0.54；精子復(fù)蘇率最高，達(dá)69.2%。C組凍精活力、精子復(fù)蘇率均顯著高于A、D、E、F組（P＜0.05）。

表2 初凍溫度對精子復(fù)蘇率的影響Tab.2 Effect of initial freezing temperature on sperm resuscitation rate

結(jié)果表明，精液冷凍后精子活力的差異由冷凍時不同的溫度變化所決定，冷凍溫度過低或過高，精液降溫速率過快或過慢，精子活力均會受到影響。精液只有在適宜的溫度范圍內(nèi)冷凍才能獲得理想的冷凍效果。

本研究中，C組和B組精液降溫速率分別為36.7和38.2℃/min，精子復(fù)蘇率分別為69.2%和66.7%，與前期研究報道的35℃/min的降溫速率趨于一致[10]。

3 討論

使用簡易泡沫箱，采用靜止的液氮蒸氣熏蒸法進(jìn)行冷凍，在液氮面和箱口平面間會自然地形成溫度梯度。距離液氮面越近，溫度越低，與凍前細(xì)管的溫差也越大，此方法是依靠調(diào)節(jié)冷凍面距液氮面的高低控制初凍溫度和降溫速率。本試驗中，不同的距離條件下，精液的初凍溫度、熱平衡溫度、降溫速率和精液入氮所經(jīng)過的時間不同。液氮面與冷凍面間的距離越近，初凍溫度越低，精液降溫速率越快，冷凍過程時間越短；液氮面與冷凍面間的距離越遠(yuǎn)，初凍溫度越高，精液降溫速度越慢，冷凍過程時間越長。在其他相同的條件下，由于冷凍面與液氮面之間高度不同，會影響初凍溫度、回升溫度、降溫速率和冷凍時間。

本試驗中，液氮面與冷凍面之間的距離為3.0 cm時，在開始冷凍后96 s達(dá)到-85℃的熱平衡溫度，經(jīng)500 s達(dá)到-130℃以下，解凍后精子活力0.54。侯放亮[11]報道，精液在-80～-110℃適宜范圍內(nèi)，達(dá)到熱平衡溫度及安全溫度的時間短，精液冷凍后精子復(fù)蘇率得到提高，與本試驗結(jié)論一致。在精液冷凍過程中，冷凍溫度和降溫速率是影響精子冷凍后活力的主要因素。距離液氮面越近，溫度越低，與凍前細(xì)管精液的溫差越大，精液降溫速率快，而精液降溫速率是影響精子復(fù)蘇率的主要因素。本試驗中，鹿精液冷凍初凍的適宜溫度為-160.3～-169.7℃，9～11 min內(nèi)達(dá)到并維持此溫度區(qū)域后再繼續(xù)降溫直至存入液氮，與金穗華[12]報道的冷凍的溫度控制在-140℃左右，冷凍過程控制在8 min內(nèi)的結(jié)論不一致，可能與冷凍容器大小、一次冷凍細(xì)管精液的數(shù)量不同有關(guān)。

精液降溫變化曲線的斜率取決于冷凍速率，而冷凍速率主要取決于精子與稀釋液之間的溫差。溫差大時，降溫速率較快，曲線斜率越顯著。有研究表明，精液在不同溫區(qū)的降溫速率不同[13]。精液在5～-100℃溫區(qū)時，細(xì)管和冷凍面接觸后，精液溫度迅速下降，隨著降溫梯度由液態(tài)變?yōu)榻Y(jié)晶態(tài)；此后精液溫度緩慢下降。當(dāng)精液溫度達(dá)到-130℃時，精液由結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)。

精液冷凍過程中的降溫是技術(shù)的難點。冷凍過程中，精細(xì)胞內(nèi)、外形成冰晶的大小主要取決于降溫速率，若溫差不大，降溫速率較慢，則緩慢地形成大冰晶。精細(xì)胞內(nèi)大冰晶的形成可對精子產(chǎn)生不可逆的機(jī)械損傷，導(dǎo)致精子死亡?？焖俳禍氐乃俾蚀嬖谝欢ㄏ薅?，為避免由于冰晶形成和電解質(zhì)濃度變化而嚴(yán)重?fù)p傷精子，適宜的降溫速率非常重要。精液冷凍過程中，若能避開細(xì)胞慢速降溫時脫水和快速降溫時的冰晶的損害，溫度安全達(dá)到-130℃，冷凍即可獲得成功[14]。

細(xì)胞對溫度的反應(yīng)敏感，除添加防凍害的保護(hù)劑外，還可采取控制降溫速率以減少或消除凍害。-60～0℃是冰晶形成的溫度區(qū)域，尤其-15～-25℃危險區(qū)域。冰晶是在逐漸降溫的條件下形成的，降溫越慢，形成的冰晶越大。因此，玻璃化必須在-250～-60℃的低溫區(qū)域內(nèi)，經(jīng)快速降溫，迅速越過冰晶化而進(jìn)入玻璃化階段[15]。

4 結(jié)論

采用簡易裝置冷凍細(xì)管精液，精液經(jīng)降溫平衡后采用液氮蒸氣熏蒸冷凍，通過調(diào)整液氮面與冷凍面之間距離控制精液初凍溫度，若使用得當(dāng)同樣能夠獲得較為理想的冷凍效果。選擇合適的精液冷凍溫度和降溫速率極其重要，應(yīng)根據(jù)每次冷凍細(xì)管精液數(shù)量適當(dāng)調(diào)整液氮面與冷凍面之間的距離。