孫鈺博，禹方曉，韋英益，于美玲，梁萬文，李 旻，覃志彪*，胡庭俊*

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021）

羅非魚蛋白質(zhì)含量較高[1]，肉質(zhì)白嫩，且富含人體所需的8種必需氨基酸，享有“白肉三文魚”“21世紀(jì)之魚”等美稱。羅非魚養(yǎng)殖要求低，近年來已成為養(yǎng)殖、加工、出口的水產(chǎn)新星。但養(yǎng)殖戶操作不良或水體環(huán)境惡劣，常導(dǎo)致羅非魚群暴發(fā)細(xì)菌性疾病。代表性病原菌包括無乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌，以無乳鏈球菌最為典型[2]。養(yǎng)殖戶常為預(yù)防此類疾病而在水體和餌料中濫用抗生素，導(dǎo)致藥殘嚴(yán)重超標(biāo)、出貨優(yōu)品率下降等問題。因此，找到低藥殘、低污染、純天然綠色的中草藥迫在眉睫。

黃連、黃芩和大黃均具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。其中，黃芩的臨床抗菌性更優(yōu)，且不產(chǎn)生抗藥性[3]。三黃連散由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，是黃連、黃芩和大黃等中藥配伍制成的復(fù)方中草藥散劑，可應(yīng)用于預(yù)防羅非魚無乳鏈球菌病[4-6]。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三黃連散對靶動物（羅非魚）的安全性評價(jià),為三黃連散的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

三黃連散由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院研制，山西首愛動物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)（批號：20170703，規(guī)格：每克含黃芩苷不少于80 mg，包裝：100 g/袋）。

1.1.2 試驗(yàn)飼料

羅非魚膨化配合餌料403（百洋產(chǎn)業(yè)投資集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，編號：Q/BYS 003—2019，凈含量25 kg/袋）；水產(chǎn)藥物及餌料專用黏合劑（北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司生產(chǎn)，凈含量250 g/袋）。

1.1.3 試驗(yàn)動物

150尾羅非魚，每尾重50～100 g，臨床健康，未檢出無乳鏈球菌等致病菌，購自廣西水產(chǎn)研究所羅非魚養(yǎng)殖基地。試驗(yàn)前進(jìn)行場地適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。每日投喂飼料量按魚體重的3%稱取，每日投喂2次（9：00、18：00）。

1.2 給藥方式

采用與臨床應(yīng)用相同的給藥途徑，拌餌投喂。餌料粉碎，取相應(yīng)重量的三黃連散與等重量黏合劑混合，加適量水?dāng)嚢?，與餌料攪拌混勻。陰干8 h，分裝后密封保存于塑料袋，4℃保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取已經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d且規(guī)格相同的羅非魚150尾，隨機(jī)分為5組，分別為對照組以及1、3、5、10倍劑量組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚，分別飼養(yǎng)于400 L的塑料桶中。試驗(yàn)期14 d。連續(xù)飼喂7 d后停止投藥，只投喂基礎(chǔ)飼料。于試驗(yàn)第8、第15 d采樣。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)條件不變。具體分組處理見表1。

表1 三黃連散靶動物安全性試驗(yàn)分組及處理Tab.1 Grouping and treatment of safety test of three coptis isolated target animals

1.4 樣品前處理

每尾魚血液樣本分為2份：0.50 mL血液加抗凝劑EDTA-K2混勻，立即測定全血常規(guī)生理指標(biāo)；剩余血液保存于無菌EP管，4℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，取血清，分裝標(biāo)記，-80℃保存，以測定血清生化指標(biāo)。采集肝、脾，以10%福爾馬林固定，應(yīng)用于病理組織學(xué)檢查。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 臨床癥狀

試驗(yàn)期間觀察記錄各組羅非魚的臨床表現(xiàn)和采食情況等。若試驗(yàn)期間羅非魚出現(xiàn)臨床病理變化或死亡等異常情況，詳細(xì)記錄情況出現(xiàn)時(shí)間、數(shù)量和臨床癥狀等，解剖死亡魚并確定死亡原因。

1.5.2 生長性能

試驗(yàn)開始前和給藥后的第8、第15 d，分別稱量記錄羅非魚的體重。采血后處死魚，采摘完整的肝臟和脾臟進(jìn)行稱重并記錄，計(jì)算肝臟指數(shù)脾臟和指數(shù)。

1.5.3 血液生理指標(biāo)的測定

取抗凝全血檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、淋巴細(xì)胞（LY）、粒細(xì)胞（GRAN）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞比容（HCV）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞分布寬度變異指數(shù)（RDW-CV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）指標(biāo)，均使用全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

1.5.4 血液生化指標(biāo)的測定

取離心后的血清檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總蛋白、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、總膽固醇、肌酐、總膽紅素、甘油三酯、血尿素氮和堿性磷酸酶指標(biāo)，均采用南京建成試劑盒測定，操作步驟參照說明書。

1.5.5 病理組織學(xué)檢查

取10%的福爾馬林固定后的肝、脾，包埋切片、HE染色，鏡檢，觀察臟器內(nèi)中各細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三黃連散對羅非魚體重及器官指數(shù)的影響（見表2、表3）

由表2可知，給藥7 d后各組的增重率、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 給藥7 d對羅非魚體重及臟器指數(shù)的影響Tab.2 Weight and organ indexes after seven days of administration

由表3可知，停藥7 d后，與對照組相比，3倍劑量組和10倍劑量組羅非魚的增重率均顯著降低（P＜0.05）。各組初重、末和肝臟、脾臟指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 停藥7 d對羅非魚體重及臟器指數(shù)的影響Tab.3 Weight and organ indexes after seven days of withdrawal

2.2 三黃連散對羅非魚血液生理指標(biāo)的影響（見表4、表5）

表5 停藥7 d對羅非魚血液生理指標(biāo)的影響Tab.5 Blood physiological indexes after seven days of withdrawal

由表4可知，給藥7 d后，與對照組相比，1倍劑量組、5倍劑量組和10倍劑量組的GRAN和MCH均顯著降低（P＜0.05），各劑量組的MCV均極顯著降低（P＜0.01），各劑量組的MCHC均極顯著升高（P＜0.01）。

表4 給藥7 d對羅非魚血液生理指標(biāo)的影響Tab.4 Blood physiological indexes after seven days of administration

各組WBC、LY、RBC、HGB、HCV、RDW-CV、PLT均無顯著差異（P＞0.05）。

續(xù)表5 停藥7 d對羅非魚血液生理指標(biāo)的影響Tab.5（continue）Blood physiological indexes after seven days of withdrawal

由表5可知，與對照組相比，停藥7 d后，5倍劑量組和10倍劑量組的WBC均極顯著降低（P＜0.01）；各劑量組的MCV和MCH均極顯著降低（P＜0.01）；5倍劑量組的LY、GRAN和MCHC均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 三黃連散對羅非魚血液生化指標(biāo)的影響（見表6、表7）

表7 停藥7 d對羅非魚血液生化指標(biāo)的影響Tab.7 Blood biochemical indexes after seven days of withdrawal

由表6可知，與對照組相比，給藥7 d后，5倍劑量組的白蛋白含量極顯著升高（P＜0.01），10倍劑量組的總蛋白含量極顯著升高（P＜0.01）。

表6 給藥7 d對羅非魚血液生化指標(biāo)的影響Tab.6 Blood biochemical indexes after seven days of administration

各組堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性以及甘油三酯、肌酐、血尿素氮、總膽固醇、總膽紅素的含量均無顯著差異（P＞0.05）。

由表7可知，與對照組相比，停藥7 d后，3倍劑量組的白蛋白含量極顯著升高（P＜0.01）；1倍劑量組總蛋白含量顯著升高（P＜0.05），3倍劑量組的總蛋白含量顯著降低（P＜0.05）；5倍劑量組和10倍劑量組的甘油三酯的含量顯著升高（P＜0.05），1倍劑量組數(shù)值有所增高，但差異不顯著（P＞0.05）；5倍劑量組和10倍劑量組的總膽固醇含量極顯著降低（P＜0.01）；10倍劑量組肌酐含量顯著升高（P＜0.05）。

各組堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性及血尿素氮、總膽固醇的含量則均無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 組織切片結(jié)果（見圖1～圖4）

圖1 給藥7 d羅非魚肝臟病理組織學(xué)結(jié)果Fig.1 Histopathological results of liver of tilapia after seven days administration

圖2 停藥7 d羅非魚肝臟病理組織學(xué)結(jié)果Fig.2 Histopathological results of liver of tilapia after seven days of withdrawal

由圖1～圖4可知，于給藥7 d和停藥7 d后解剖羅非魚，經(jīng)眼觀和組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，三黃連散各劑量組臟器均無明顯眼觀病變，病理組織切片未發(fā)現(xiàn)藥物引起的細(xì)胞毒性變化。

3 討論

鏈球菌病一直是羅非魚養(yǎng)殖戶面臨最大的難題[7]，其中以無乳鏈球菌感染首當(dāng)其沖。目前，漁業(yè)高密度養(yǎng)殖的環(huán)境下，無乳鏈球菌病初期病癥不明顯，很可能造成難以估計(jì)的損失。因此，養(yǎng)殖戶為節(jié)約成本，多選擇大劑量、大面積地潑灑抗生素類藥物，導(dǎo)致鏈球菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[8]。近年來，有關(guān)部門嚴(yán)令禁止飼料中添加抗生素，要求生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)僅可添加中藥類促生長類飼料添加劑；在多重因素的影響下，進(jìn)一步促進(jìn)了中獸藥制劑的研發(fā)。

多種中草藥有效成分均具有良好的抗菌效果，能夠提高動物的生長性能。陳奇等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的山豆根多糖對人工感染羅非魚鏈球菌病具有不同程度抵抗效果，可有效降低羅非魚感染無乳鏈球菌后的病死率。徐晴等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對感染鼠傷寒沙門氏菌的小鼠具有明顯的治療作用。薛芳翰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對鼠傷寒沙門氏菌的生長繁殖具有顯著抑制作用，可能與藥物干擾細(xì)菌細(xì)胞膜通透性有關(guān)。王寧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物對常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等致病菌具有較明顯的體內(nèi)外抑菌作用。倪建騰等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃連、黃芩體外對鮑曼不動桿菌具有一定的抑制作用。阿木古楞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮、訶子、黃芩等3味蒙藥對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌綜合抑菌效果均可達(dá)到極度敏感或高度敏感的程度。張照紅[15]研究發(fā)現(xiàn)，大黃、黃芩和黨參等7種中藥制成的復(fù)方制劑，連續(xù)飼喂羅非魚45 d，可表現(xiàn)顯著增重作用。獸用中草藥制劑發(fā)展前景廣闊，為水產(chǎn)養(yǎng)殖的防病、治病提供了新思路。

三黃連散是由廣西大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，經(jīng)過中獸醫(yī)辨證論治、科學(xué)配伍研制而成的中獸藥復(fù)方制劑。靶動物安全試驗(yàn)通過飼喂羅非魚不同劑量的三黃連散，檢測器官指數(shù)、血液生理指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理組織學(xué)細(xì)胞形態(tài)的變化，得到三黃連散對羅非魚的臨床影響情況。

本研究中，羅非魚各器官指數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，各劑量組羅非魚的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均無顯著差異，表明三黃連散對羅非魚臟器無明顯毒副作用。

本研究中，羅非魚的血液生理指標(biāo)顯示，與對照組相比，各三黃連散劑量組羅非魚的平均紅細(xì)胞體積均顯著降低，表明羅非魚代謝能力增強(qiáng)[16]；給藥期間各劑量組的平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度均極顯著升高，表明羅非魚血液氧氣運(yùn)輸量增加[17-18]。

本研究中，羅非魚的血液生化指標(biāo)顯示，與對照組相比，停藥前后1、5、10倍劑量組的總蛋白含量均顯著升高，且總蛋白含量隨中藥劑量升高而增加，表明三黃連散可促進(jìn)機(jī)體代謝速度及蛋白質(zhì)的吸收與合成[19]。停藥前各劑量組總膽固醇含量未見明顯增高，表明使用三黃連散不會引起羅非魚體內(nèi)脂肪堆積[20]，對脂質(zhì)代謝造成壓力[21]。停藥7 d后，5、10倍劑量組總膽紅素含量均顯著降低，但丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶的活性等均無顯著差異，表明三黃連散對羅非魚肝臟功能無不良影響[22]。停藥前后，1、3、5倍劑量組血尿素氮和肌酐含量均無顯著差異，表明三黃連散對羅非魚的腎臟功能無不良影響。

本試驗(yàn)病理組織學(xué)結(jié)果顯示，停藥前后各劑量組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝臟細(xì)胞清晰可見，與對照組比均無明顯的病理變化，表明三黃連散對代謝和免疫無影響。停藥前后各劑量組與對照組的脾臟組織切片上均存在少量含鐵血黃素，與黃明[23]的試驗(yàn)結(jié)果相似，可能與紅細(xì)胞的生長和凋亡有關(guān)。病理切片顯示無其他明顯的病理變化和細(xì)胞毒性變化，表明三黃連散對羅非魚對造血和免疫無影響。結(jié)合停藥前后的各項(xiàng)檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)分析表明，1～10倍推薦劑量的三黃連散對羅非魚無不良影響。

4 結(jié)論

以三黃連散臨床推薦劑量的1、3、5、10倍，連續(xù)給藥7 d及停藥7 d后，各劑量組羅非魚均未出現(xiàn)臨床病理變化，且臟器指數(shù)、血液生理指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理組織學(xué)結(jié)果與對照組相比均無顯著差異。研究表明，三黃連散在1～10倍推薦劑量下連續(xù)飼喂安全可靠。