續(xù) 言， 王景蕓， 吳宜靜， 張一鳴， 朱梓寧， 蔡 明， 潘會堂， 張啟翔

(北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院， 北京 100083)

紫薇(Lagerstroemiaindica)是千屈菜科紫薇屬的重要木本花卉，為我國原產(chǎn)樹種，有較為悠久的栽培歷史，自唐代就被作為觀賞花木栽培。紫薇屬植物在夏季少花季節(jié)開花，花色豐富、花期長達3個多月，是良好的園林綠化樹種[1]。花香是園林植物重要的觀賞性狀之一，但有色少香是紫薇觀賞性狀的一個缺憾。尾葉紫薇(L.caudata)是紫薇屬中具有明顯花香的品種，常被用作香花育種的重要親本。但尾葉紫薇為小喬木，花色單一，花徑小，且尾葉紫薇與其他紫薇品種的雜交后代香味減弱。因此，仍需通過多種育種手段選育綜合性狀優(yōu)良的香花紫薇新品種。

化學(xué)誘變育種是利用化學(xué)藥劑改變植物的遺傳物質(zhì)，并將優(yōu)良的突變材料培育成為新品種的育種方法[2]。甲基黃酸乙酯(EMS)誘變劑是化學(xué)誘變劑中烷化劑的典型代表，具有高效低毒，可誘導(dǎo)高密度的系列等位基因點突變的特點，被公認(rèn)為世界上最有效和廣泛使用的化學(xué)誘變劑之一。利用EMS誘變技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了非洲菊[3]、菊苣[4]、觀賞辣椒[5]、長春花[6]、春蘭[7]、大花萱草[8]、旱柳[9]、木槿[10]等觀賞植物的突變體庫。

紫薇EMS誘變開始于美國，1998年Whitcomb利用EMS技術(shù)誘導(dǎo)，獲得了顏色鮮紅、復(fù)色花及可持續(xù)開花等8個各具特色的優(yōu)良紫薇品種[11]。國內(nèi)對紫薇的EMS誘變育種研究開始較晚，伍漢斌等[12]以南紫薇種子為材料，用不同濃度EMS溶液對南紫薇種子進行處理，研究了EMS處理對紫薇種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，得到EMS誘變紫薇種子的半致死濃度為3%處理6 h。

本研究用EMS對尾葉紫薇的成熟種子進行處理，研究在不同處理濃度和時間下EMS對尾葉紫薇種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，篩選EMS誘變尾葉紫薇的最佳條件，為香花紫薇優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗材料為尾葉紫薇成熟種子，2020年8月采摘于北京市昌平區(qū)國家花卉工程中心小湯山基地。EMS誘變劑采購自SIGMA公司。

1.2 方 法

將尾葉紫薇的成熟種子用蒸餾水浸泡一夜進行預(yù)處理。以不含誘變劑的蒸餾水為對照組，設(shè)置濃度梯度分別為0.5%、1%、2%、4%的EMS溶液，處理時間分別為4 h、8 h、12 h。使用大而飽滿的尾葉紫薇成熟種子進行實驗處理，每個重復(fù)50粒種子，3組重復(fù)，共45個處理。將處理后的種子用5%的硫代硫酸溶液沖洗30 min后再用蒸餾水沖洗2 h，將清洗后的種子均勻播于墊有濕潤試紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。再次重復(fù)上述處理，將清洗后的種子點播在國家花卉工程中心小湯山基地溫室內(nèi)，進行正常的養(yǎng)護管理。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1種子萌發(fā)的測定

定時觀察播種后的萌發(fā)情況，以種子露白作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天按時統(tǒng)計各處理的發(fā)芽數(shù)，連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)不再變化時視為發(fā)芽結(jié)束。測定種子的發(fā)芽勢，統(tǒng)計發(fā)芽率。計算公式如下：

發(fā)芽勢(%)=(處理后9 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(處理后14 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%。

1.3.2根長測定

將誘變后的尾葉紫薇種子培養(yǎng)至10 d，使用游標(biāo)卡尺測量尾葉紫薇根長，每個重復(fù)隨機選擇10株測量，重復(fù)3次，取根長的平均值。

1.3.3EMS誘變半致死劑量的確定

相對發(fā)芽率(%)=(處理組的發(fā)芽率/對照組的發(fā)芽率)×100%；

相對發(fā)芽勢(%)=(處理組的發(fā)芽勢/對照組的發(fā)芽勢)×100%。

半致死劑量(Lethal concentration 50，LC50)以EMS處理尾葉紫薇種子的相對致死率確定，相對致死率為50%時獲得半致死劑量。

1.3.4紫薇幼苗形態(tài)學(xué)指標(biāo)的觀測

待幼苗正常生長120 d后統(tǒng)計植株的分枝數(shù)、葉片數(shù)、莖粗、株高、冠幅，選取3片成熟葉片測量葉長、葉寬并計算葉面積，葉形指數(shù)用“葉片長/葉片寬”表示，成熟葉片面積使用Adobe Photoshop CC 2019軟件處理后獲得。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用matlab 2018軟件對得到的數(shù)據(jù)進行分析，通過數(shù)學(xué)建模獲得尾葉紫薇EMS誘變處理的理論半致死劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對尾葉種子萌發(fā)的影響

將尾葉紫薇種子播種在培養(yǎng)皿6 d后，對照組的種子最先開始萌發(fā)(最早出苗的是蒸餾水處理4 h和蒸餾水處理12 h)；第7天起，0.5%和1%處理4 h、處理8 h組和0.5%處理12 h組開始萌發(fā)，第8天除4%處理組外其余處理組均開始萌發(fā)。隨著EMS濃度升高和處理時間延長，萌發(fā)時間推遲越長，到第9天，萌發(fā)起始完全結(jié)束；直至第14天，各處理組萌發(fā)數(shù)基本確定。結(jié)果表明，EMS處理能夠抑制尾葉紫薇種子的萌發(fā)，且EMS的濃度越高，處理時間越長，抑制作用越明顯。與對照組相比，誘變組尾葉紫薇種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨EMS濃度的升高都呈逐漸下降的趨勢，且EMS濃度越高，萌發(fā)數(shù)值越低，與對照組差異極顯著。

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。下同。圖1 各處理組種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢Fig.1 Germination rate and germination potential of seeds in each treatment group

由圖1可知，不同濃度的EMS誘變劑對尾葉紫薇種子浸泡4 h后的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢都有顯著影響，且表現(xiàn)出一定的規(guī)律。與對照組相比，發(fā)芽率、相對發(fā)芽率均隨EMS濃度的升高而降低，且濃度越高，發(fā)芽率下降越快。低濃度的EMS溶液處理對種子萌發(fā)的抑制作用不明顯，0.5%處理的相對發(fā)芽率達80%以上，且與對照組的差異不顯著；高濃度的EMS溶液處理抑制作用明顯，2%～4%梯度下，相對發(fā)芽率下降了32.73%，下降速率最快。且隨著濃度的升高，發(fā)芽勢也呈降低趨勢，發(fā)芽勢的變化規(guī)律與發(fā)芽率基本相同。與4 h處理的變化規(guī)律相同，8 h、12 h的EMS溶液處理對尾葉紫薇種子的萌發(fā)具有抑制作用，經(jīng)過長時間的EMS處理后，不同組別間的差異極顯著(p<0.01)。且隨著濃度的升高和處理時間的延長，抑制作用逐漸增強。在4%濃度下處理8 h、12 h種子全部致死。

2.2 不同EMS處理對尾葉紫薇根長的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，EMS處理對尾葉紫薇根的形態(tài)造成了影響。相同處理濃度下，處理時間越長，根長越短，EMS處理濃度與根長關(guān)系也呈相同的變化規(guī)律。從圖2可知，不同處理時間對尾葉紫薇種子幼苗根長影響達極顯著(p<0.01)，不同處理濃度對尾葉紫薇根長也存在極顯著影響，處理濃度和處理時間相互作用時，根長變化也呈顯著差異。

圖2 各處理組根長Fig.2 Root length of each treatment group

2.3 尾葉紫薇EMS處理半致死劑量的初步選擇

由表1可知，EMS處理抑制了尾葉紫薇的萌發(fā)，處理時間越長，濃度越高，相對致死率越高。低濃度處理4 h對尾葉紫薇種子的萌發(fā)效應(yīng)不顯著，0.5%處理4 h后相對致死率與對照組沒有顯著差異，但4%處理后相對致死率顯著增加，達到80.91%。方差分析結(jié)果顯示，隨著處理時間的增加，各組別之間差異極顯著(p<0.01)，說明不同的處理濃度和處理時間對尾葉紫薇種子萌發(fā)的相對致死率有極顯著影響。半致死劑量通常作為有效誘發(fā)植物產(chǎn)生突變的適宜誘變劑量。本實驗表明，2%濃度處理4 h的相對致死率為48.18%，1%濃度處理12 h的相對致死率為58.25%，以上2種處理最接近半致死劑量，經(jīng)過比較初步確定EMS處理尾葉紫薇的半致死劑量為2%處理4 h。

表1 不同處理對尾葉紫薇萌發(fā)相對致死率的影響Table 1 Effects of different treatments on the germination relative lethal rate of Lagerstroemia caudata

2.4 尾葉紫薇EMS處理理論半致死劑量的選擇

相對致死率的變化受處理濃度和處理時間的影響，但本實驗數(shù)據(jù)較為分散，無法準(zhǔn)確估計半致死劑量。插值函數(shù)被廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)分析中，指在離散數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上補插連續(xù)函數(shù)，使得這條連續(xù)曲線通過全部的離散數(shù)據(jù)點[13]。采用“雙線性插值”的方法對實異極顯著(p<0.01)。下同。

驗數(shù)據(jù)進行處理，既可以保證插值結(jié)果在實驗數(shù)據(jù)點上的誤差為零，又可以保證插值結(jié)果符合之前定性分析中得出的相對致死率隨處理濃度和處理時間的變化趨勢。本次試驗利用matlab軟件自帶的插值函數(shù)interp 2在matlab軟件內(nèi)編程實現(xiàn)。最終通過線性插值的方法得到如圖3所示的模型，揭示了處理時間、處理濃度和相對致死率的變化規(guī)律，可以快速獲得大量實驗數(shù)據(jù)。將相對致死率(z)=50%代入模型中，可以得到處理濃度和處理時間的具體值。本實驗中，當(dāng)處理濃度為0.78%、處理時間為12 h時，取得EMS最低濃度下誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量；當(dāng)處理濃度為2.11%、處理時間為4 h時，取得最短處理時間下的誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量。

圖3 使用matlab得到的不同處理組尾葉紫薇半致死率的函數(shù)Fig.3 The function of half-lethal rate of Lagerstroemia caudata in different treatment groups obtained using matlab

2.5 不同濃度處理對尾葉紫薇幼苗生長的影響

不同濃度EMS溶液處理4 h后，正常養(yǎng)護管理生長120 d的植株進行形態(tài)學(xué)測量，結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過不同濃度的EMS處理后，尾葉紫薇幼苗的生長受到了一定的影響，4%處理下，尾葉紫薇的分枝數(shù)明顯多于其他處理組，與其他處理組的差異極顯著，說明高濃度的EMS處理可促進尾葉紫薇分枝。隨著EMS處理濃度的增加，尾葉紫薇幼苗的株高呈先升后降的趨勢，2%處理組的株高最高，達48.79 cm。莖粗和冠幅對EMS處理的響應(yīng)不明顯，各處理組間沒有表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律。同時，由表3可知，4%處理組的葉片數(shù)、葉形指數(shù)、葉面積都大于其他處理組，表現(xiàn)為促進作用，且與其他處理組的差異極顯著。但是在低濃度的EMS處理后，葉形指數(shù)在2.0～2.2之間，葉面積在11～13 cm2之間波動，處理組的葉片形態(tài)與對照組沒有明顯的差異。

表2 不同濃度處理對尾葉紫薇幼苗生長的影響Table 2 Effects of different concentrations on the growth of Lagerstroemia caudata seedlings

表3 不同濃度處理對尾葉紫薇幼苗葉片的影響Table 3 Effects of different concentration treatments on the leaves of Lagerstroemia caudata seedlings

3 結(jié)論與討論

EMS誘變簡單高效，對植物染色體的損傷較小，被用于植物體各個部位組織、器官的誘變。吸脹后的種子吸收誘變劑的速率非常高，能夠使更多的誘變劑以更快的速度進入胚組織，成為實驗中最常見的誘變材料之一[14-15]。

不同處理濃度和處理時間對尾葉紫薇種子的發(fā)芽時間、發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及幼苗根的生長都有顯著的影響。處理濃度和處理時間是決定EMS誘變的關(guān)鍵因素，且經(jīng)EMS溶液處理后，尾葉紫薇種子的發(fā)芽起始時間和發(fā)芽進程都出現(xiàn)了一定程度的延緩，說明EMS處理能夠抑制種子的萌發(fā)。幼苗對水分和養(yǎng)分的吸收情況與根的長度有關(guān)，根的長度過于短小不利于幼苗吸收營養(yǎng)，高濃度EMS誘變下尾葉紫薇幼苗成活率較低可能與此有關(guān)。有研究證明，低濃度的EMS處理可以促進部分植物種類的種子萌發(fā)，如醉魚草[16]、知母[17]、無芒雀[18]等，這可能與不同物種種皮的透水性、種子的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及種子的休眠機制有關(guān)。

在本次試驗中，2%濃度處理4 h尾葉紫薇成熟種子的相對致死率為48.18%，1%濃度處理12 h的相對致死率為58.25%，以上2種處理最接近半致死濃度。在進行誘變實驗時可以選擇2%處理4 h作為處理方式。本試驗采用“雙線性插值”的方法對實驗數(shù)據(jù)進行處理，通過數(shù)學(xué)分析得出，當(dāng)處理濃度為0.78%、處理時間為12 h時，取得EMS最低濃度下誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量；當(dāng)處理濃度為2.11%、處理時間為4 h時取得最短處理時間下的誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量。

當(dāng)前紫薇屬植物的EMS誘變研究較少，伍漢斌等[12]在對南紫薇種子進行EMS誘變試驗時得出，3.0%EMS濃度處理6 h為誘變南紫薇種子的半致死劑量，本實驗的結(jié)果與之有較大差異，可能是尾葉紫薇與南紫薇的種間差異性。在其他木本觀賞植物中，慎家輝等[19]探索了EMS對杜梨的誘變效應(yīng)，得到0.3%處理24 h為杜梨誘變的最佳劑量，Dhakshanamoorthy等[20]得到EMS誘變麻風(fēng)樹的半致死劑量為3%處理8 h；孫慧[21]根據(jù)萌發(fā)率和成苗率確定海濱木槿種子的適宜誘變濃度為1.5%，誘變處理時間4 h；朱翠翠等[22]對青檀種子的研究發(fā)現(xiàn)，1.2%～1.5%EMS濃度處理48 h為青檀種子的半致死劑量。這說明不同植物對EMS處理的敏感性不同，誘變效果存在很大差異。

研究發(fā)現(xiàn)，浸種時間越長，尾葉紫薇的萌發(fā)率越高。對照組處理12 h，發(fā)芽率、發(fā)芽勢明顯高于4 h處理組。在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，EMS誘變處理尾葉紫薇種子時，較高的環(huán)境溫度可以提高萌發(fā)率。結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于突變頻率提高?？勺鳛榻窈髮嶒灥奶剿饕罁?jù)。

EMS處理對尾葉紫薇后期的生長產(chǎn)生了一定的影響。高濃度的EMS處理可以促進尾葉紫薇分枝和葉片增大，較低濃度的EMS處理可以促進株高增長。在冠幅、莖粗等方面，EMS處理的效應(yīng)不明顯。但誘變效應(yīng)具有很大的隨機性，處理組間個體差異性較大，具體變化規(guī)律仍需加大實驗量再次進行統(tǒng)計。

本實驗設(shè)置了不同的濃度梯度，在3個不同處理時間下使用EMS溶液對尾葉紫薇進行浸種，通過對各處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢以及幼苗根的長度、苗期生長狀況等指標(biāo)進行研究分析，最終獲得了尾葉紫薇種子各種指標(biāo)在EMS處理條件下的變化規(guī)律，使用統(tǒng)計軟件進行分析獲得了處理時間和處理濃度的相互作用關(guān)系。通過對半致死劑量的初步估計，確定了尾葉紫薇EMS誘變的適宜劑量為2%濃度處理4 h。同時使用matlab軟件建造模型預(yù)測了EMS誘變尾葉紫薇種子的理論半致死組合，對播種后的幼苗進行了初步的形態(tài)學(xué)分析統(tǒng)計。試驗結(jié)果可為尾葉紫薇的誘變體庫建立及誘變育種提供參考。