張娟 李雪 蔣浩 黃曉萍

宮頸癌在全球女性常見惡性腫瘤中居第四位，在發(fā)展中國家常見惡性腫瘤中居第二位。當(dāng)前的治療策略包括手術(shù)切除、化學(xué)治療和放射治療，但療效均有限。如何預(yù)防與治療宮頸癌是全球醫(yī)學(xué)工作者們共同關(guān)注的課題。竹節(jié)香附素A（RDA）是從常用的傳統(tǒng)中草藥海葵中提取的一種活躍三萜皂苷，通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成產(chǎn)生抗腫瘤活性，同時(shí)能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，如大腸癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B/ 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號通路是一條常見的細(xì)胞信號通路，由于mTOR 能調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動(dòng)，因此被作為抑制腫瘤細(xì)胞生長的靶點(diǎn)。有研究者發(fā)現(xiàn)，RDA 可能通過激活p38MAPK 通路和抑制mTOR 活化誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。RDA 在宮頸癌中未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探究RDA 對人宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料

人宮頸癌HeLa 細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。RDA，純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司，批號20190203；胰島素樣生長因子-1（IGF-1），純度≥98%，貨號PHG0078，購自美國Gibco 公司。

二、主要試劑和儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，均購自美國Gibco 公司；B 細(xì)胞淋巴瘤2 家族蛋白（Bcl-2）抗體、β-actin 抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）抗體、mTOR 抗體、PI3K 抗體、Akt 抗體、羊抗兔二抗均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

BA400Digital 數(shù)碼三目攝像顯微鏡為麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件為美國Media Cybernetics 公司產(chǎn)品，SpectraMAX Plus384 酶標(biāo)儀為美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品，Cytoflex 流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品。

三、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

將已經(jīng)凍存HeLa 細(xì)胞株快速在37 ℃下解凍后，加入適量高糖DMEM 完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+0.5%青鏈霉素雙抗），調(diào)整細(xì)胞密度為1×10/mL，在37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h，中途更換完全培養(yǎng)基2～3 次，然后進(jìn)行傳代備用。

2.實(shí)驗(yàn)分組

濃度篩選試驗(yàn)：將細(xì)胞分成5 組（0、5、10、20 和40 μmol/L），藥物干預(yù)48 h。機(jī)制檢測試驗(yàn)：將細(xì)胞分為空白對照組、IGF-1 組（100 ng/L）、RDA 組（20 μmol/L）與聯(lián)合用藥組（IGF-1 100 ng/L+RDA 20 μmol/L），各組藥物均干預(yù)48 h。

3. CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖率

待HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，使用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×10/L，每孔取100 μL 細(xì)胞懸液加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全生長貼壁后棄去培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液清洗2 次。將RDA 溶于完全培養(yǎng)基，調(diào)整終濃度為0、5、10、20 和40 μmol/L，每孔加入200 μL 含RDA 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。藥物干預(yù)48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，然后使用酶標(biāo)儀測定在450 nm 波長下的吸光度值（A），以0 μmol/L 濃度的吸光度為對照值，根據(jù)公式計(jì)算培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞增殖率，并計(jì)算半抑制濃度（IC），每組3 個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將處于生長對數(shù)期的HeLa 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基制成1×10/mL 的細(xì)胞懸液，每孔取1 mL 細(xì)胞懸液加入6 孔板中，37 ℃、5%CO條件下培養(yǎng)24 h使細(xì)胞生長貼壁，分別按照前述步驟分組培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞48 h，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。每組3 個(gè)復(fù)孔，凋亡結(jié)果取平均值。

5.蛋白免疫印跡法檢測各蛋白表達(dá)水平

分別按照前述步驟分組培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞48 h，然后收集細(xì)胞行蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、p-Akt、p-mTOR 蛋白的表達(dá)量，并計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。每組3 個(gè)復(fù)孔，蛋白表達(dá)結(jié)果取平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)；析因設(shè)計(jì)資料組間比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析，交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用LSD-t 檢驗(yàn)分析單獨(dú)效應(yīng)，P ＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度RDA 對HeLa 細(xì)胞凋亡的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，與0 μmol/L 組相比，5 μmol/L 濃度以上RDA 對HeLa 細(xì)胞有抑制作用（P ＜ 0.05），抑制程度與RDA 濃度呈正相關(guān)，IC為20.90 μmol/L；細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，5 μmol/L濃度以上RDA 對HeLa 有促進(jìn)凋亡的作用（P ＜0.05），凋亡程度與RDA 濃度呈正相關(guān)，見圖1、表1。

表1 不同濃度RDA 作用下HeLa 細(xì)胞的增殖率與凋亡率比較（，n=3）單位：%

圖1 不同濃度RDA 干預(yù)后HeLa 細(xì)胞的凋亡情況

二、不同濃度RDA 對HeLa 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示，與0 μmol/L 組相比，20、40 μmol/L 組中Bax 和Cleaved-caspase-3 的表達(dá)量均升高，Bcl-2 的表達(dá)降低（P 均＜ 0.05），0、5 μmol/L RDA 對HeLa 中Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3 凋亡蛋白表達(dá)無明顯影響，10 μmol/L RDA 對Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)無明顯影響（P均＞ 0.05），見圖2、表2。

表2 不同濃度RDA 作用下HeLa 細(xì)胞中Bcl-2、Bax 及Cleaved-caspase-3 的蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n = 3）

三、RDA 對HeLa 細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示，與0 μmol/L 組相比，10、20 和40 μmol/L 組3 種蛋白磷酸化表達(dá)量均降低（P 均＜ 0.05）。5 μmol/L 組3 種蛋白磷酸化表達(dá)量有降低趨勢，但p-Akt 和p-mTOR 與0 μmol/L 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05），見圖2、表3。綜合前述結(jié)果，采用40 μmol/L 的RDA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 不同濃度RDA 作用下HeLa 細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 的蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n = 3）

圖2 不同濃度RDA 干預(yù)HeLa 后凋亡蛋白與PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白的表達(dá)情況

四、激活PI3K/Akt/mTOR 通路后RDA 對HeLa 細(xì)胞的影響

檢測與析因分析結(jié)果顯示，IGF-1 和RDA 對細(xì)胞增殖率與凋亡率的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者的交互作用對細(xì)胞增殖率（F = 11.028，P =0.006）與凋亡率（F = 48.494，P ＜ 0.001）有影響；估算邊際平均值后發(fā)現(xiàn)RDA 對細(xì)胞增殖率與凋亡率影響明顯，見表4。

表4 IGF-1 與RDA 對HeLa 細(xì)胞增殖率與凋亡率的效應(yīng)分析（±s，n = 3） 單位：%

與空白對照組相比，IGF-1 組細(xì)胞增殖率與凋亡率無明顯變化（P ＞ 0.05），RDA 組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞的增殖率下降，凋亡率上升（P ＜ 0.05）；與IGF-1 組相比，RDA 組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞的增殖率下降，凋亡率上升（P ＜ 0.05），RDA 組抑制HeLa 細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡的效果比聯(lián)合用藥組更明顯（P ＜ 0.05），見表5、圖3。

圖3 激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路后RDA 對HeLa 細(xì)胞凋亡的影響

表5 IGF-1 與RDA 對HeLa 細(xì)胞增殖率與凋亡率的影響（±s，n = 3） 單位：%

五、激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路后RDA對HeLa 細(xì)胞中該信號通路蛋白表達(dá)的影響

析因分析結(jié)果顯示，IGF-1 和RDA 對p-PI3K（F = 72.804，P ＜ 0.001；F = 23.819，P = 0.001）、p-Akt（F = 36.510，P ＜ 0.001；F = 5.317，P ＜0.001）、p-mTOR（F = 45.504，P ＜ 0.001；F =11.982，P = 0.009）的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者的交互效應(yīng)對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 無影響（F = 0.272，P = 0.616；F = 1.291，P = 0.289；F =0.013，P = 0.912），估算平均邊際值后發(fā)現(xiàn)RDA對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 影響明顯，見表6。故主要解析各因素的主效應(yīng)作用，其中IGF-1 與RDA對HeLa 細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR 信號通路影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IGF-1 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路為激活效應(yīng)，而RDA 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路表現(xiàn)抑制效應(yīng)，見表7、圖4。

圖4 激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路后RDA 對HeLa 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響

表6 IGF-1 與RDA 對HeLa 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達(dá)效應(yīng)分析（±s，n = 3）

表7 激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路后RDA 對HeLa 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白的影響（±s，n = 3）

討 論

研究表明，RDA 可在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，如肝癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等，說明RDA 有著強(qiáng)大的抗腫瘤活性。由此推測RDA對宮頸癌可能有一定的抗癌作用。本研究采用人宮頸癌HeLa 細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，從細(xì)胞凋亡率和PI3K/Akt/mTOR 信號通路等方面探討RDA 對人宮頸癌細(xì)胞的抑制作用。研究結(jié)果顯示，5～40 μmol/L 的RDA 對HeLa 細(xì)胞均有抑制作用，且抑制效果與RDA 濃度呈正相關(guān)，初步顯示RDA 對HeLa 細(xì)胞具有明顯的抑制效果。

Caspase 是一組在細(xì)胞凋亡過程起關(guān)鍵作用的酶，而Bcl 家族在抑制Bcl-2 或促進(jìn)Bax 導(dǎo)致細(xì)胞死亡的途徑中也起著關(guān)鍵作用。本研究顯示，5～40 μmol/L 的RDA 能對HeLa 細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡作用，且作用隨RDA 濃度的升高而增強(qiáng)，同時(shí)，20～40 μmol/L 的RDA 能使HeLa 細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax 和Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)升高，這說明RDA 不僅對HeLa 細(xì)胞既有抑制增殖作用，也有促進(jìn)凋亡作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路廣泛存在于多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，是目前惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。該通路在腫瘤細(xì)胞的能量代謝、細(xì)胞增殖、侵襲能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在許多人類惡性腫瘤（包括宮頸癌）中異常激活。p-Akt和p-mTOR 蛋白在50%～53%的宮頸腺癌中均有表達(dá)，說明這2 種蛋白磷酸化過表達(dá)可能是導(dǎo)致宮頸癌的原因之一。本研究顯示，使用RDA 干預(yù)HeLa 細(xì)胞后，p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 這3 種蛋白的相對表達(dá)量均降低，且抑制作用隨RDA 濃度的升高而增強(qiáng)。由此說明，RDA 能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路，降低HeLa 細(xì)胞增殖率。

IGF-1 通過活化Akt 激活下游信號通路，是胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和PI3K/Akt 通路的強(qiáng)效刺激因子。有研究者發(fā)現(xiàn)，IGF-1 促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的有絲分裂、轉(zhuǎn)移和抗凋亡，有助于腫瘤細(xì)胞的維持和促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。因此本研究探討在PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活的環(huán)境下，RDA 是否能發(fā)揮同樣的抗癌效果。結(jié)果顯示，IGF-1 和RDA 存在交互作用，RDA 的單獨(dú)效應(yīng)隨IGF-1 變化，說明RDA 可能對IGF-1 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡的效果有抑制作用。與IGF-1 組相比，聯(lián)合用藥組能明顯降低細(xì)胞增殖率且提高細(xì)胞凋亡率，但效果不如單用RDA，說明在IGF-1的干預(yù)下，RDA 仍然能發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生存的效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1 和RDA 的交互作用并沒有對p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量產(chǎn)生影響，說明IGF-1 此時(shí)的作用只是單純的PI3K/Akt/mTOR 信號通路激動(dòng)劑，并未對RDA產(chǎn)生直接影響。與空白對照組相比，IGF-1 組的p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量升高，說明IGF-1 激活了HeLa 細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR信號通路。而RDA 能降低IGF-1 干預(yù)后p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量，說明無論P(yáng)I3K/Akt/mTOR 信號通路是處于正常狀態(tài)還是異常激活狀態(tài)，RDA 都能抑制HeLa 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3K、Akt 和mTOR 蛋白的磷酸化，從而誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞死亡，阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，RDA 能對人宮頸癌HeLa 細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖與促進(jìn)凋亡的作用，其作用機(jī)制是通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，降低p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生抗癌的效果。