任海霞 閆華楠 牛淑利 郭永澤 李博 張宏偉 安凱

臨床上很多肝硬化患者會出現(xiàn)腹痛、腹瀉等胃腸道疾病，考慮與腸道菌群紊亂有關。近年來“腸-肝軸”已經成為人們關注的熱點，且證明腸道菌群紊亂會影響肝硬化的進展[1]。研究表明，不良的口腔微環(huán)境與肝臟之間可能存在聯(lián)系，但目前關于“口腔-腸-肝軸”的研究較少。本研究通過16S rRNA基因測序初步探討肝硬化患者口腔及腸道菌群的變化，旨在調節(jié)口腔及腸道菌群來減緩肝硬化的進展。

資料與方法

一、研究對象

選取河北工程大學附屬醫(yī)院及邯鄲市傳染病醫(yī)院2020年6月至2020年11月臨床診斷為肝硬化的患者19例作為肝硬化組，選擇同期健康體檢者19名作為健康組，采集以上人群的糞便及唾液標本。本課題已通過河北工程大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，受試者均自愿參與并簽署了知情同意書。

二、入選標準

健康組：年齡、性別、體重指數(body mass index ，BMI)與肝硬化組相匹配，無消化系統(tǒng)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、神經系統(tǒng)疾病、器官功能障礙等，實驗室指標均正常。

肝硬化組：影像學檢查并結合臨床診斷為肝硬化，診斷符合《肝硬化診治指南》[2]，可合并腹水、肝性腦病、肝癌、食管/胃底靜脈曲張(OB轉陰)等并發(fā)癥。

三、排除標準

①有其他器官功能障礙；②合并糖尿病、高血壓、癌癥、乳糜瀉、炎癥性腸病和代謝綜合征；③4周內接受抗生素、益生菌治療；④有牙科病史和口腔檢查發(fā)現(xiàn)有活動性牙齦或牙周??；⑤孕婦或哺乳期婦女。

四、標本采集

唾液采集：晨起床后不刷牙，用清水將口腔內的摻雜物洗漱干凈，手持無菌、無酶收集管，保持唾液在口中持續(xù)至少1 min，收集2～5 mL。-86℃凍存。

糞便采集：早晨空腹前用糞便取樣器截取樣品中段里部，取50～100 mg，每個樣品取2管備份，-86 ℃凍存。

五、DNA提取及16SRNA 基因測序

糞便及唾液樣本均采用Qubit?dsDNA BR Assay 試劑盒 (美國Invitrogen)提取，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質量。取30 ng DNA樣品及融合引物配置PCR反應體系。針對16SRNA V3-V4可變區(qū)域進行PCR擴增。使用引物(341F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG/806R GACTACHVGGGTWTCTAAT)。使用 Agencourt AMPure XP 磁珠進行純化并溶于 Elution Buffer，貼上標簽，至此文庫構建完成，文庫檢測使用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測文庫的片段范圍及濃度，將檢測合格的文庫，采用lllumina Hiseq2500進行測序，測序類型為PE300。

六、生物信息學分析

下機數據過濾，剩余高質量的Clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關系將reads拼接成Tags；將Tags聚類成OTU并與Greengene數據庫比對、 物種注釋；基于OTU和注釋結果進行樣品物種復雜度分析，組間物種差異分析，以及關聯(lián)分析與模型預測等。

七、統(tǒng)計學方法

結 果

一、一般資料

肝硬化組男13例，女6例，年齡為(49.7±11.0)歲，BMI為(24.01±2.26)kg/m2；健康對照組男9例，女10例，年齡為(49.2±9.4)歲，BMI為(23.18±1.56)kg/m2；兩組年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.144、1.314，均P>0.05)。

二、兩組OTU聚類Venn圖

將研究對象的糞便樣本及唾液樣本經Illumina測序，根據有效數據97%的類似進行OTU聚類，并繪制Venn圖(圖1)。健康組腸道共有OTU 526個，口腔共有OTU 436個；肝硬化組腸道共有OTU 642個，口腔共有OTU 534個。4組樣本共有72個OTU相互重疊，其中健康組口腔及腸道共有82個OTU相互重疊，肝硬化組口腔及腸道共有160個OTU相互重疊。表明口腔與腸道物種雖然存在一定差異，但也存在相同的物種，且肝硬化組與健康組相比口腔與腸道重疊物種更多。

注：HCFe為健康組糞便；HCSa為健康組唾液；HSFe為肝硬化組糞便；HSSa為肝硬化組唾液

三、Alpha多樣性分析

一般從Shannon、Chao1、Simpson、ACE等來評估物種的多樣性及豐富度，Shannon指數和Simpson指數可以反映物種的多樣性，Chao1指數和ACE指數可以反映物種的豐富度。與健康組相比，肝硬化組腸道菌群多樣性及豐富度均出現(xiàn)下降，口腔菌群的多樣性及豐富度也均出現(xiàn)下降，見表1。繪制稀釋曲線，隨著測序深度的增加曲線會逐漸上升，當測序達到一定深度則曲線不再上升，說明多樣性已經達到飽和，如圖2所示稀釋曲線趨于平坦，說明此樣本量下能夠很好地反映腸道及口腔物種的多樣性。

表1 健康組與肝硬化組口腔及腸道菌群的豐富度與多樣性比較

圖2 口腔及腸道樣本的稀釋曲線

四、Beta多樣性分析

Beta多樣性，不僅可以反映樣本之間的多樣性距離關系，而且還可以反映生物群落之間的分化程度，通過PCOA(principal coordinate analysis)分析口腔及腸道菌群之間的差異性，PC1的貢獻率為51.78%，PC2的貢獻率為6.96%。結果所示腸道和口腔樣本之間明顯分離，說明無論是否合并肝硬化口腔和腸道菌群均明顯不同，且糞便樣本間的距離要明顯大于唾液樣本間的距離，說明腸道菌群個體間的差異性要大于口腔菌群個體間的差異性。見圖3。

圖3 口腔及腸道菌群的Unweighted-Unifrac PCOA圖

五、兩組間口腔和腸道菌群分類學組成分析

通過與數據庫進行比對，對OTU進行物種分類，并分別在門和屬水平對各樣品作物種豐度柱狀圖。結果如圖4所示，在門水平上腸道及口腔中的主要物種均是由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門，在屬水平上，盡管口腔和腸道菌群組成差異明顯，但有部分菌屬是口腔及腸道共有的。腸道菌群在門水平上，肝硬化組變形菌門豐度顯著高于健康組(P<0.05)，而擬桿菌門豐度低于健康組(P>0.05)；在屬水平上，肝硬化組毛螺菌屬豐度顯著低于健康組，而大腸桿菌屬、韋榮球菌屬豐度顯著高于健康組(均P<0.05)?？谇痪涸陂T水平上，肝硬化組厚壁菌門豐度顯著高于健康組，而變形菌門豐度顯著低于健康組(均P<0.05)；在屬水平上，韋榮球菌屬、纖毛菌屬豐度顯著高于健康組，而嗜血桿菌屬豐度顯著低于健康組(均P<0.05)。

注：左圖為門水平，右圖為屬水平

討 論

口腔和腸道都是人體消化系統(tǒng)最重要的組成部分，目前已經發(fā)現(xiàn)食道癌、結腸炎癥及腫瘤、胰腺癌等疾病均有口腔和腸道菌群的參與[3-5]。文獻報道，慢性肝病患者腸道菌群會出現(xiàn)明顯的改變，肝硬化出現(xiàn)并發(fā)癥如腹水、HE和靜脈曲張破裂出血患者更容易出現(xiàn)牙周炎[6,7]，因此猜測口腔和腸道菌群對肝硬化患者的發(fā)生發(fā)展有重要作用。

本研究中Venn圖示口腔和腸道存在特有的OTU，也有部分OTU存在相互重疊，而肝硬化患者與健康組相比口腔和腸道菌群相互重疊的OTU更多，說明口腔和腸道菌群有相同的物種存在，且肝硬化患者口腔和腸道菌群存在更多的相同物種。進一步從物種組成豐度柱狀圖上分析發(fā)現(xiàn)在門水平上腸道和口腔中的物種均是由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門組成，而在屬水平上口腔和腸道菌群雖然組成成分上有很大區(qū)別，但有共同菌屬存在；PCOA結果顯示無論是否合并肝硬化口腔和腸道菌群均明顯不同，且腸道菌群個體間的差異性要大于口腔菌群個體間的差異性；Alpha多樣性指數分析結果表明肝硬化患者口腔和腸道菌群多樣性及豐富度均出現(xiàn)下降，說明肝硬化患者口腔和腸道菌群出現(xiàn)了明顯的失衡，上述研究結果與文獻報道一致[8-10]。

通過口腔和腸道菌群分類學組成分析結果發(fā)現(xiàn)門水平上，在腸道菌群中肝硬化患者變形菌門顯著增加，在口腔菌群中，肝硬化患者厚壁菌門豐度顯著增加，而變形菌門豐度顯著降低，因此變形菌門可能是肝硬化患者一種潛在的生物標志物。變形菌門在口腔及腸道中均占有優(yōu)勢，研究表明肥胖、糖尿病、UC、IBD等疾病均會出現(xiàn)變形菌門失衡[11-13]。在屬水平上發(fā)現(xiàn)口腔和腸道菌群中韋榮球菌均增加，韋榮球菌在肝硬化患者的口腔及腸道紊亂中可能有重要作用，韋榮球菌在口腔菌群中富集，正常情況下可以促進口腔黏膜屏障的形成[14]，但在異常情況下就會成為條件致病菌引起口腔疾病并且破壞口腔黏膜屏障進入到腸道。因此考慮肝硬化患者韋榮球菌的增加可能是口腔菌群侵入到腸道所致。

綜上所述，肝硬化患者口腔和腸道菌群出現(xiàn)明顯失衡，口腔條件致病菌增加且破壞口腔黏膜防御系統(tǒng)，引起口腔細菌向腸道移位。有研究證實口腔內細菌可以促進腸道炎癥性疾病的發(fā)生，引起腸道菌群失衡[15-16]。因此肝硬化的患者可以通過保持口腔清潔來減少條件致病菌增加，且可以口服益生菌來改善腸道菌群的紊亂，從而預防肝硬化的進展[17]。

本研究在樣本選擇過程中沒有詳細調查患者的飲食情況，且樣本量較少，今后需要擴大樣本量進一步研究。本研究初步探討了肝硬化患者口腔和腸道菌群的改變，對于肝硬化患者差異菌群的具體作用以及口腔和腸道菌群之間細菌移位機制仍需要進一步研究。