李卿，李軼君，張國(guó)銳

食管癌起病隱匿，早期可無癥狀，手術(shù)切除是治療食管癌最主要的手段，但患者手術(shù)后仍可發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，以致死亡［1-2］。該病重在早期診斷，而目前尚缺乏可靠、準(zhǔn)確的分子標(biāo)志物。因此，探索食管癌發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制，尋找新的早期診斷標(biāo)志物成為食管癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。研究表明，miR-25 在腫瘤中異常表達(dá)，能影響乳腺癌［3］、肺癌［4］、胃癌［5］、肝癌［6］等多種腫瘤的進(jìn)展，但在食管癌中的報(bào)道少見。鹽誘導(dǎo)激酶1（salt-inducible kinase 1，SIK1）是一種蛋白編碼基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、代謝、機(jī)體穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［7-10］。本研究通過檢測(cè)食管癌組織和癌旁組織中miR-25的表達(dá)差異，探討過表達(dá)和干擾miR-25表達(dá)通過SIK1影響食管癌細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制，并進(jìn)一步驗(yàn)證外泌體來源的miR-25能否作為食管癌無創(chuàng)診斷的標(biāo)志物，為食管癌的早期診斷和優(yōu)化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集2015 年1 月—2020 年6 月在湖南省郴州市第一人民醫(yī)院胸心外科行手術(shù)治療的食管癌患者，選擇經(jīng)病理或消化內(nèi)鏡診斷明確的處于早期（0～Ⅰ期）的原發(fā)性食管癌54例，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療以及其他輔助治療。手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織標(biāo)本均于-80 ℃低溫冰箱中凍存?zhèn)溆?。按?∶1配對(duì)原則，選擇性別匹配、年齡相差5 歲且無胃腸道疾病的體檢健康者54 例作為對(duì)照。本研究經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人食管癌細(xì)胞EC109 購(gòu)于國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒、4%多聚甲醛固定液、細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；lipofectamine 3000試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；鼠源GAPDH 一抗、兔源SIK1一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、ECL化學(xué)發(fā)光底物、TRIzol 法RNA提取試劑盒、pcDNA 3.1 和pmirGLO 質(zhì)粒均購(gòu)于生工生物工程股份有限公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購(gòu)于武漢愛博泰克生物科技有限公司；PCR引物序列由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；雙熒光素報(bào)告酶試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega 公司。多功能酶標(biāo)儀（Multiskan FC）購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司，SDS-PAGE 電泳儀（DYCZ-24DH）購(gòu)于北京六一儀器廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-18AC）購(gòu)于上海天呈科技有限公司；qPCR儀（ABI 7500）購(gòu)于美國(guó)ABI 公司；倒置顯微鏡（YKDZ-400）購(gòu)于上海永科光學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）購(gòu)于蘇潔醫(yī)療器械有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Optima XPN）購(gòu)于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；透射電鏡（JEOL JEM-2800）購(gòu)于日本電子株式會(huì)社。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-25表達(dá) 根據(jù)說明書要求，TRIzol法提取癌組織及癌旁組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行熒光定量PCR。PCR 引物序列見表1。反應(yīng)體系：SYBR premix 10 μL，PCR 上、下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火25 s，共40 個(gè)循環(huán)。miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平用U6進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 過表達(dá)和沉默miR-25對(duì)EC109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將EC109 細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 EC109細(xì)胞接種于6孔板中，預(yù)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右后將培養(yǎng)基更換成無血清、無雙抗的DMEM 培養(yǎng)基。按照lipofectamine 3000 試劑盒的操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染組包含：miR-25 過表達(dá)組（miR-25 mimic 組）、過表達(dá)對(duì)照組（NC mimic 組）、miR-25 干擾組（miR-25 inhibitor 組）和干擾對(duì)照組（NC inhibitor 組）。NC mimic、miR-25 mimic、NC inhibitor 和 miR-25 inhibitor 均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。轉(zhuǎn)染完成后按照1.3中方法檢測(cè)miR-25表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染效率。

1.4.3 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力 Transwell 小室用基質(zhì)膠預(yù)先孵育2 h，期間將轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞用胰蛋白酶消化。用不含血清和雙抗的DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為5×105個(gè)/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入到Transwell 小室上室中，將 Transwell 小室置于 24 孔板中，下室加入 600 μL 含有20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫室溫下染色15 min，最后用脫脂棉球輕輕擦去Transwell上室中未發(fā)生侵襲的細(xì)胞。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則直接將消化后的細(xì)胞稀釋至 5×105個(gè)/mL，取 100 μL 細(xì)胞懸液加入到 Transwell 上室中，然后在下室中同樣加入600 μL 含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，24 h 后對(duì)上室中的細(xì)胞進(jìn)行固定染色。將Transwell小室晾干后置于顯微鏡下拍照，并分別計(jì)算細(xì)胞侵襲和遷移的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 miR-25的靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

1.5.1 Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-25 的靶基因 使用Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)miR-25的潛在靶點(diǎn)是否包含SIK1基因。

1.5.2 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。對(duì)樣品進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h。用含1%吐溫20 的TBS 洗膜，加入一抗（1∶5 000）于4 ℃孵育過夜，隨后用二抗（1∶10 000）37 ℃孵育1.5 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行顯影，用凝膠成像儀捕獲條帶圖像，然后用Image J 軟件進(jìn)行半定量分析。以GAPDH 作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次。

1.5.3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將SIK1 的野生型和突變型序列分別克隆到pmirGLO 質(zhì)粒上。miR-25 mimic 和miR-25 inhibitor與SIK1 3'UTR野生型和突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至EC109細(xì)胞，并以各自NC序列作為對(duì)照。48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.6 Transwell 檢測(cè) miR-25 靶向 SIK1 對(duì) EC109 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 EC109 細(xì)胞分為pcDNA 3.1 組、SIK1 過表達(dá)組和miR-25+SIK1 過表達(dá)組。分組轉(zhuǎn)染后Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-25 靶向SIK1 對(duì)EC109 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，實(shí)驗(yàn)步驟同1.4.3。

1.7 血漿外泌體的提取及miR-25 表達(dá)水平檢測(cè) 將54 例食管癌患者和健康對(duì)照者的血漿樣本300×g離心10 min，2 000×g離心 15 min，以去除細(xì)胞碎片，然后 12 000×g離心30 min，去除上清液，得到外泌體。使用0.22μm的過濾器進(jìn)行過濾除菌，最后適量磷酸鹽緩沖液重懸浮。外泌體提取后參照1.3中實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)miR-25的表達(dá)量，并分析食管癌患者癌組織與血漿外泌體中miR-25表達(dá)的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用graphpad prism 8.0.3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織和癌旁組織中miR-25表達(dá)水平比較 食管癌組織中miR-25 相對(duì)表達(dá)水平高于癌旁組 織（6.00±3.34vs.1.49±0.78，t=9.665，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 qPCR detection of the relative expression level of miR-25 in esophageal cancer tissues and adjacent tissues圖1 qPCR檢測(cè)miR-25在食管癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 miR-25在EC109細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染48 h后，miR-25 mimic 組 miR-25 表達(dá)水平較 NC mimic組上調(diào)約 8.40 倍（t=18.700，P＜0.01），而 miR-25 inhibitor 組 miR-25 表達(dá)水平較 NC inhibitor 組下調(diào)約33.6%（t=10.220，P＜0.01），見圖2。

Fig.2 Overexpression and interference efficiency of miR-25 in EC109 cells detected by qPCR圖2 qPCR檢測(cè)miR-25在EC109細(xì)胞中的過表達(dá)和干擾效率

2.3 過表達(dá)和敲低miR-25 對(duì)EC109 細(xì)胞侵襲和遷移的影響 Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，與NC mimic 組相比，miR-25 mimic 組侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05）。miR-25 inhibitor 組中侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)較NC inhibitor組下降（P＜0.05），見圖3、表2。

Fig.3 Migration and invasion of EC109 cells after overexpression and knockdown of miR-25 were detected by Transwell assay(×100)圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)和敲低miR-25后EC109細(xì)胞的遷移和侵襲能力（×100）

Tab.2 Effects of overexpression and knockdown of miR-25 on migration and invasion of EC109 cells表2 過表達(dá)和敲低miR-25的各組EC109細(xì)胞遷移和侵襲能力變化 （n=3，個(gè)/視野，）

Tab.2 Effects of overexpression and knockdown of miR-25 on migration and invasion of EC109 cells表2 過表達(dá)和敲低miR-25的各組EC109細(xì)胞遷移和侵襲能力變化 （n=3，個(gè)/視野，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別NC mimic組miR-25 mimic組t細(xì)胞侵襲數(shù)73.0±6.9 93.0±5.9 3.794＊細(xì)胞遷移數(shù)69.3±3.2 87.4±2.1 8.153＊＊組別NC inhibitor組miR-25 inhibitor組t細(xì)胞侵襲數(shù)73.6±7.4 36.7±5.4 6.947＊＊細(xì)胞遷移數(shù)72.7±3.1 39.1±5.9 8.770＊＊

2.4 miR-25 的靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 通過Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) SIK1 為 miR-25 的靶基因，見圖 4。Western blot 結(jié)果顯示 miR-25 過表達(dá)后，SIK1 的相對(duì)蛋白表達(dá)量較NC mimic 組下降（0.25±0.07vs.0.92±0.08，t=11.680，P＜0.01）。敲低miR-25后SIK1的蛋白表達(dá)量較NC inhibitor 組升高（0.79±0.05vs.0.44±0.08，t=6.369，P＜0.01），見圖5。

Fig.4 Targetscan database predicts the 3'UTR binding of miR-25 to SIK1圖4 Targetscan預(yù)測(cè)miR-25與SIK1的3'UTR結(jié)合

Fig.5 The effect of overexpression and knockdown of miR-25 on the expression of SIK1 detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)過表達(dá)和敲低miR-25對(duì)SIK1表達(dá)量的影響

2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，miR-25 mimic 與SIK1 3'UTR 野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞熒光素酶活性降低（P＜0.01），見圖6。而miR-25 inhibitor 與 SIK1 3'UTR 野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 EC109 細(xì)胞后，熒光素酶活性升高（P＜0.01），見圖7。

Fig.6 Double luciferase reporter assay confirmed the change of luciferase activity after the simultaneous action of miR-25 mimic and SIK1 3'UTR圖6 雙熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-25 mimic與SIK1 3'UTR同時(shí)作用后熒光素酶活性的變化

Fig.7 Double luciferase reporter assay confirmed the change of luciferase activity after the simultaneous action of miR-25 inhibitor and SIK1 3'UTR圖7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-25 inhibitor與SIK1 3'UTR同時(shí)作用后熒光素酶活性的變化

2.6 miR-25通過靶向SIK1促進(jìn)EC109細(xì)胞的侵襲和遷移 Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，與pcDNA 3.1 組相比，SIK1 過表達(dá)組EC109 侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量減少，而miR-25+SIK1過表達(dá)組EC109侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量較SIK1過表達(dá)組增多，見圖8、表3。

Fig.8 Transwell experiment verified that miR-25 promoted the invasion and migration of EC109 through SIK1(×100)圖8 Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-25通過SIK1促進(jìn)EC109的侵襲和遷移（×100）

Tab.3 Effects of SIK1 overexpression on migration and invasion of EC109 cells表3 SIK1過表達(dá)各組對(duì)EC109細(xì)胞遷移和侵襲的影響（n=3，個(gè)/視野，）

Tab.3 Effects of SIK1 overexpression on migration and invasion of EC109 cells表3 SIK1過表達(dá)各組對(duì)EC109細(xì)胞遷移和侵襲的影響（n=3，個(gè)/視野，）

＊＊P＜0.01。

組別pcDNA3.1組SIK1過表達(dá)組miR-25+SIK1過表達(dá)組F細(xì)胞侵襲數(shù)97.5±6.6 46.7±6.6a 67.8±8.1ab 38.280＊＊細(xì)胞遷移數(shù)72.5±2.2 33.2±3.9a 59.9±8.0ab 43.320＊＊

2.7 食管癌患者和健康對(duì)照血漿外泌體中miR-25的相對(duì)表達(dá)量 食管癌患者血漿外泌體中miR-25的相對(duì)表達(dá)量高于健康對(duì)照（t=8.534，P＜0.01），與在食管癌組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致，見圖9。

Fig.9 qPCR detection of miR-25 expression in esophageal cancer and healthy human plasma exosomes圖9 qPCR檢測(cè)食管癌和健康人血漿外泌體中miR-25的表達(dá)量

2.8 miR-25 在食管癌組織和血漿外泌體中的表達(dá)相關(guān)性 外泌體中miR-25 的相對(duì)表達(dá)量與食管癌患者組織中的相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.767，P＜0.01），見圖10。

Fig.10 Correlation of miR-25 expression in esophageal cancer tissue and plasma圖10 miR-25在食管癌組織和血漿中的表達(dá)相關(guān)性

3 討論

食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，好發(fā)于中老年男性。食管癌患者早期治療預(yù)后較好，但患者整體生存率仍然較低，究其原因主要是發(fā)現(xiàn)食管癌時(shí)患者多已處于中晚期，導(dǎo)致治療后容易復(fù)發(fā)［11-12］。因此，迫切需要尋找新的食管癌診斷標(biāo)志物以早期診斷，從而改善食管癌患者預(yù)后。

外泌體是一種直徑在50～150 nm 的細(xì)胞外囊泡，廣泛存在于各種體液中。外泌體是脂質(zhì)雙分子層，能夠保護(hù)囊泡內(nèi)的miRNA 不被RNA 酶降解，從而保證miRNA 濃度穩(wěn)定。外泌體的內(nèi)容物可反映母體細(xì)胞的特性，因此外泌體在腫瘤等疾病的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)等方面具有較大潛力［13］。外泌體來源的miRNA 能夠作為前列腺癌、結(jié)腸癌的無創(chuàng)的診斷標(biāo)志物［14-15］，能否作為食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物仍不明確。研究表明，miR-25能夠參與多種腫瘤的進(jìn)展，主要包括促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲［16］，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［17］，調(diào)控細(xì)胞周期［18］及自噬［19］等。在本研究中，筆者首先通過臨床標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-25 在食管癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，與Liu等［20］研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-25 后，EC109 細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)，說明miR-25可能參與了食管癌的進(jìn)展。隨后，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIK1是miR-25的靶基因。既往有研究表明，SIK1 活化可以促進(jìn)p53 相關(guān)細(xì)胞失巢凋亡，并抑制細(xì)胞的克隆性生長(zhǎng)［21］，且SIK1 表達(dá)降低與乳腺癌［21］、胰腺癌［22］、肝細(xì)胞癌［23］和卵巢癌［24］的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。因此，SIK1被認(rèn)為是抑癌基因。然而，SIK1在食管癌中的表達(dá)狀況及其臨床意義尚不清楚。本研究證實(shí)，過表達(dá)SIK1能夠抑制食管癌EC109細(xì)胞侵襲和遷移，而miR-25靶向抑制SIK1表達(dá)后，EC109細(xì)胞侵襲和遷移能力較過表達(dá)SIK1 組升高，提示miR-25 可能是通過影響SIK1 的表達(dá)來調(diào)節(jié)EC109 細(xì)胞的生物學(xué)特性。最后，筆者發(fā)現(xiàn)食管癌患者血漿外泌體中的miR-25表達(dá)水平明顯高于健康人群，且與食管癌組織中的表達(dá)量呈正相關(guān)，提示外泌體miR-25可能作為食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

本研究證實(shí)，miR-25可能通過外泌體分泌到外周血中發(fā)揮生物學(xué)功能，具有早期診斷食管癌的潛力。后續(xù)將納入其他分期的食管癌標(biāo)本，研究不同分期的食管癌中miR-25的表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)進(jìn)一步挖掘miR-25 在食管癌中發(fā)揮的其他功能以及與SIK1相關(guān)的信號(hào)通路，以期明確其具體作用機(jī)制。