鐘曉鳴，劉洪洋，張蕾，姚新亮，魯雪莉，許瑾瑾，程冠昌

基于細(xì)胞的心肌修復(fù)和再生療法是目前治療心力衰竭和缺血性心臟病的一種有潛力的療法［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種骨髓來源的非造血干細(xì)胞，具有自我更新和多能分化的潛力，可以分化為心肌細(xì)胞來修復(fù)受損的心肌，從而改善心臟功能，這種基于細(xì)胞的療法對(duì)于心肌修復(fù)和再生具有重要意義［2］。使用5-氮雜胞嘧啶（5-azacytidine，5-AZA）在體外將BMSCs 誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞是一種較為傳統(tǒng)的方法，但5-AZA 會(huì)引起細(xì)胞損傷［3］。因此，尋找一種安全的誘導(dǎo)BMSCs 向心肌細(xì)胞分化的方法至關(guān)重要。有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA 胰島素樣生長(zhǎng)因子2反義轉(zhuǎn)錄物（long non-coding RNA insulin-like growth factor 2 antisense transcript，lncRNA IGF2-AS）可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞分化［4］，IGF2-AS 能以表觀遺傳DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1依賴性的方式調(diào)控有義同源基因胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）的表達(dá)［5］。但lncRNA IGF2-AS 對(duì)BMSCs 心肌樣分化的影響以及能否通過調(diào)控IGF2影響B(tài)MSCs心肌樣分化尚鮮見報(bào)道。因此，本研究主要探究lncRNA IGF2-AS 對(duì)BMSCs 心肌樣分化的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 周齡體質(zhì)量 20～30 g 的 6 只 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2020-0055。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵循3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 pLVX-IRES-Zs Green1 載體、si-IGF2-AS、si-IGF2 及 si-IGF2-AS 和 si-IGF2 的陰性對(duì)照 si-NC 均購(gòu)自廣州萊德爾生物科技有限公司；pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS 質(zhì)粒由廣州基迪奧生物科技有限公司合成；胎牛血清（FBS）、低糖DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自上海西格生物科技有限公司；5-AZA購(gòu)自湖北漢達(dá)飛生物科技有限公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Pierce? Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit 購(gòu)自上海創(chuàng)賽科技有限公司；MTT試劑盒、RNA免疫沉淀（RIP）試劑盒購(gòu)自廣州賽誠(chéng)生物科技有限公司；大鼠CD29-PE、CD90-PE-CyTM7、CD45-FITC 抗體購(gòu)自美國(guó) BD 公司；IGF2、間隙連接蛋白43（Cx43）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、β-actin 兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA試劑盒均購(gòu)自鄭州金圖生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs的分離與培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行BMSCs的分離與培養(yǎng)。將大鼠脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡10 min，在超凈臺(tái)中分離四肢長(zhǎng)骨，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，剪掉骨骺端露出骨髓腔，利用無血清培養(yǎng)基將骨髓沖至15 mL離心管中，離心，棄上清液，利用含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，傳代至第3代時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并利用倒置顯微鏡觀察原代細(xì)胞、第3代細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.2 BMSCs 表面抗原的鑒定 取第3 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后用PBS洗滌3次，在常溫下以1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入PBS 重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，分為6個(gè)試管，每管加入100μL細(xì)胞懸液，并分別加入CD29-PE、CD90-PE-CyTM7、CD45-FITC及其對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，4 ℃下避光孵育20 min，在常溫下以1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs 表面抗原CD29、CD90、CD45的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞分組 利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并將第3代生長(zhǎng)良好的BMSCs 分為對(duì)照組（未做任何處理）、空載體組（轉(zhuǎn)染pLVX-IRES-Zs Green1 載體）、lncRNA IGF2-AS 組（轉(zhuǎn)染pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS）、5-AZA組（8μmol/L 5-AZA 處理）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-IGF2-AS 組（轉(zhuǎn)染si-IGF2-AS）、si-IGF2 組（轉(zhuǎn)染si-IGF2）、lncRNA IGF2-AS+si-NC 組（pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS 與 si-NC 共轉(zhuǎn)染）、lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 組（pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2-AS與si-IGF2共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染48 h后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 qRT-PCR 檢 測(cè) IGF2-AS mRNA 表達(dá) 使用 TRIzol 試劑從各組細(xì)胞中分離總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。所有反應(yīng)均在20μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃15 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，利用 2-ΔΔCt法分析 IGF2-AS 的相對(duì)表達(dá)量。IGF2-AS 引物序列：上游5'-CCCCTGACCAAGAGACCAAC-3'，下游 5'-TGAAATGGTACGACAGCGGC-3'。GAPDH 引物序列：上游5'-CACTGAGGACCAGGTTGTCT-3'，下游5'-TGTCGTACCAGGAAATGAGC-3'。

1.2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集各組細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為6×107/L，分別取100 μL 加入到96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入80μL低糖DMEM培養(yǎng)液，再加入20μL MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的光密度（OD）。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 利用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，使用BCA試劑盒評(píng)估蛋白質(zhì)濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總蛋白（30μg）。分離的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入一抗IGF2（1∶2 000）、Cx43（1∶2 000）、cTnT（1∶1 000）、cTnI（1∶1 000）、β-actin（1∶1 500），在4 ℃下孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，再加入HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗（1∶1 000），于室溫下孵育1 h，通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)水平，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件量化蛋白質(zhì)條帶。

1.2.7 RNA 下拉檢測(cè) 利用Pierce?Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit 進(jìn)行RNA 下拉檢測(cè)。將生物素化的NC 和IGF2-AS分別轉(zhuǎn)染到BMSCs中。48 h后，將細(xì)胞裂解液與鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠混合形成蛋白質(zhì)-生物/RNA-磁珠復(fù)合物，用高鹽洗脫得到蛋白質(zhì)-生物/RNA 復(fù)合物，分別命名為bio-NC組、bio-IGF2-AS組，以Input作為陽(yáng)性對(duì)照。最后，通過Western blot檢測(cè)IGF2在蛋白質(zhì)-生物/RNA混合物中的相對(duì)表達(dá)。

1.2.8 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）法檢測(cè) IGF2-AS 與IGF2蛋白結(jié)合 利用RIP試劑盒進(jìn)行RIP分析。在RIP裂解緩沖液中裂解細(xì)胞，利用蛋白A/G磁珠對(duì)IGF2抗體進(jìn)行免疫沉淀，用磁鐵固定與復(fù)合物結(jié)合的磁珠并洗掉未結(jié)合的材料，提取RNA進(jìn)行qRT-PCR分析IGF2-AS的相對(duì)表達(dá)量，免疫球蛋白G（IgG）作對(duì)照參考。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較行SNK-q檢驗(yàn)，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 形態(tài)學(xué)觀察及表面抗原鑒定 原代細(xì)胞在培養(yǎng)初期呈懸浮狀，大多數(shù)呈圓形，培養(yǎng)48 h后開始貼壁生長(zhǎng)；第3 代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列不整齊，相鄰細(xì)胞間緊密連接，呈成纖維細(xì)胞樣，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示，第3代BMSCs高表達(dá)CD29（98.21%）、CD90（92.54%），低表達(dá)CD45（3.67%），見圖2。

Fig. 1 Morphology of BMSCs observed by inverted microscope(×400)圖1 倒置顯微鏡觀察BMSCs形態(tài)（×400）

Fig. 2 Detection of surface antigens CD29,CD90 and CD45 of BMSCs by flow cytometry圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD45

2.2 過表達(dá)IGF2-AS對(duì)BMSCs中IGF2-AS表達(dá)、心肌樣分化及細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組、空載體組相 比 ，lncRNA IGF2-AS 組 、5-AZA 組 BMSCs 中IGF2-AS mRNA 表達(dá)，Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與lncRNA IGF2-AS 組相比，5-AZA 組 BMSCs 中 IGF2-AS mRNA 表達(dá)，Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，空載體組、lncRNA IGF2-AS 組、5-AZA 組細(xì)胞活力（OD 值）顯著降低，且5-AZA 組細(xì)胞活力明顯低于lncRNA IGF2-AS組，見圖3、表1。

Fig.3 Effects of overexpression of IGF2-AS on the expression of Cx43,cTnT and cTnI proteins in BMSCs detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測(cè)過表達(dá)IGF2-AS對(duì)BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)的影響

Tab.1 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by overexpression of IGF2-AS表1 過表達(dá)IGF2-AS對(duì)各組IGF2-AS mRNA表達(dá)、心肌樣分化及細(xì)胞活力比較 （n=6，）

Tab.1 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by overexpression of IGF2-AS表1 過表達(dá)IGF2-AS對(duì)各組IGF2-AS mRNA表達(dá)、心肌樣分化及細(xì)胞活力比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與空載體組比較，c與lncRNA IGF2-AS組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組F IGF2-AS mRNA 1.02±0.14 1.04±0.12 2.46±0.17ab 1.68±0.17abc 120.784＊＊Cx43/β-actin 0.41±0.03 0.45±0.04 1.72±0.16ab 1.49±0.09abc 311.133＊＊組別對(duì)照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組F cTnT/β-actin 0.62±0.04 0.66±0.05 2.03±0.25ab 1.71±0.14abc 145.234＊＊cTnI/β-actin 0.29±0.01 0.31±0.02 1.25±0.13ab 0.89±0.11abc 178.414＊＊OD490 1.27±0.12 1.06±0.11a 1.03±0.14a 0.82±0.07abc 15.953＊＊

2.3 沉默IGF2-AS對(duì)BMSCs中IGF2-AS表達(dá)、心肌樣分化及細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組、si-NC 組相比，si-IGF2-AS 組 BMSCs 中 IGF2-AS mRNA 表達(dá)，Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達(dá)顯著降低，5-AZA 組BMSCs 中 IGF2-AS mRNA 表達(dá)，Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，si-NC組、si-IGF2-AS 組、5-AZA 組細(xì)胞活力顯著降低，且5-AZA 組細(xì)胞活力明顯低于si-IGF2-AS 組，見圖4、表2。

Fig.4 Effects of silencing IGF2-AS on the expression of Cx43,cTnT and cTnI proteins in BMSCs detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)沉默IGF2-AS對(duì)BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)的影響SCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)的影響

Tab.2 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by silencing IGF2-AS表2 沉默IGF2-AS對(duì)各組IGF2-AS mRNA表達(dá)、心肌樣分化及細(xì)胞活力比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of IGF2-AS mRNA expression,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups by silencing IGF2-AS表2 沉默IGF2-AS對(duì)各組IGF2-AS mRNA表達(dá)、心肌樣分化及細(xì)胞活力比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與si-NC 組比較，c與si-IGF2-AS 組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組si-NC組si-IGF2-AS組5-AZA組F IGF2-AS mRNA 1.03±0.12 1.01±0.13 0.42±0.03ab 1.66±0.12abc 132.086＊＊Cx43/β-actin 0.43±0.04 0.46±0.03 0.15±0.01ab 1.48±0.06abc 1 318.452＊＊組別對(duì)照組si-NC組si-IGF2-AS組5-AZA組F cTnT/β-actin 0.65±0.06 0.68±0.07 0.27±0.02ab 1.73±0.14abc 330.800＊＊cTnI/β-actin 0.32±0.02 0.34±0.01 0.11±0.01ab 0.86±0.06abc 581.857＊＊OD490 1.29±0.13 1.05±0.10a 1.02±0.12a 0.84±0.08abc 17.208＊＊

2.4 IGF2-AS 上調(diào)IGF2 表達(dá) 通過生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)IGF2-AS 為IGF2 的反義轉(zhuǎn)錄本。Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組、空載體組相比，lncRNA IGF2-AS 組細(xì)胞中IGF2 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖5。與對(duì)照組、si-NC組相比，si-IGF2-AS組細(xì)胞中IGF2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖6。RNA下拉實(shí)驗(yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF2-AS能與IGF2蛋白相互作用，見圖7、8。

Fig.5 Effects of overexpression of IGF2-AS on IGF2 protein expression in BMSCs detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)過表達(dá)IGF2-AS對(duì)BMSCs中IGF2蛋白表達(dá)的影響

Fig.6 Effects of silencing IGF2-AS on IGF2 protein expression in BMSCs detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測(cè)沉默IGF2-AS對(duì)BMSCs中IGF2蛋白表達(dá)的影響

Fig.7 RNA pull-down experiment proved that IGF2 combined with IGF2-AS圖7 RNA下拉實(shí)驗(yàn)證明IGF2與IGF2-AS結(jié)合

Fig.8 The interaction between IGF2-AS and IGF2 protein verified by RIP experiment圖8 RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IGF2-AS與IGF2蛋白相互作用

2.5 沉默 IGF2 對(duì) BMSCs 中 IGF2 蛋白、心肌樣分化及細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組、si-NC 組相比，si-IGF2組BMSCs中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)顯著降低，5-AZA 組BMSCs 中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，si-NC 組、si-IGF2 組、5-AZA 組細(xì)胞活力顯著降低，且5-AZA 組細(xì)胞活力明顯低于si-IGF2 組，見圖9、表3。

Fig.9 Effects of silencing IGF2 on protein expressions of IGF2,Cx43,cTnT and cTnI in BMSCs detected by Western blot assay圖9 Western blot檢測(cè)沉默IGF2對(duì)BMSCs中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)的影響

Tab.3 Comparison of IGF2 protein,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups表3 各組IGF2蛋白、心肌樣分化及細(xì)胞活力比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of IGF2 protein,cardiomyocyte-like differentiation and cell viability between the four groups表3 各組IGF2蛋白、心肌樣分化及細(xì)胞活力比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與si-NC組比較，c與si-IGF2組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組si-NC組si-IGF2組5-AZA組F IGF2/β-actin 0.69±0.05 0.72±0.07 0.34±0.02ab 1.11±0.15abc 78.495＊＊Cx43/β-actin 0.45±0.03 0.47±0.05 0.14±0.01ab 1.42±0.09abc 635.724＊＊cTnT/β-actin 0.66±0.04 0.69±0.05 0.26±0.03ab 1.68±0.15abc 318.741＊＊cTnI/β-actin 0.35±0.01 0.37±0.02 0.12±0.01ab 0.79±0.06abc 445.095＊＊OD490 1.27±0.11 1.02±0.08a 1.01±0.09a 0.80±0.05abc 30.488＊＊

2.6 沉默 IGF2 逆轉(zhuǎn)了過表達(dá) IGF2-AS 對(duì) BMSCs 心肌樣分化的促進(jìn)作用 與對(duì)照組、空載體組相比，lncRNA IGF2-AS 組 、5-AZA 組 BMSCs 中 IGF2、Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達(dá)顯著升高，且 lncRNA IGF2-AS組相應(yīng)指標(biāo)明顯高于5-AZA組（P＜0.05）；與 lncRNA IGF2-AS 組、lncRNA IGF2-AS+si-NC 組相比，lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 組 BMSCs 中 IGF2、Cx43、cTnT、cTnI 蛋白顯著降低，但相應(yīng)指標(biāo)均高于對(duì)照組、空載體組（P＜0.05），見圖10、表4。

Fig.10 Effects of silencing IGF2 and overexpression of IGF2-AS on the protein expressions of IGF2,Cx43,cTnT and cTnI in BMSCs detected by Western blot assay圖10 Western blot檢測(cè)沉默IGF2及過表達(dá)IGF2-AS對(duì)BMSCs中IGF2、Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)的影響

Tab.4 Comparison of IGF2 protein and cardiomyocytelike differentiation between the six groups表4 各組IGF2蛋白及心肌樣分化比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of IGF2 protein and cardiomyocytelike differentiation between the six groups表4 各組IGF2蛋白及心肌樣分化比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與空載體組比較，c與lncRNA IGF2-AS組比較，d與lncRNA IGF2-AS+si-NC組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組lncRNA IGF2-AS+si-NC組lncRNA IGF2-AS+si-IGF2組F IGF2/β-actin 0.66±0.04 0.67±0.05 1.68±0.14ab 1.36±0.14abc 1.71±0.15 1.17±0.13abcd 94.817＊＊Cx43/β-actin 0.44±0.02 0.47±0.05 1.78±0.19ab 1.53±0.08abc 1.81±0.22 0.86±0.07abcd 147.902＊＊組別對(duì)照組空載體組lncRNA IGF2-AS組5-AZA組lncRNA IGF2-AS+si-NC組lncRNA IGF2-AS+si-IGF2組F cTnT/β-actin 0.64±0.05 0.67±0.06 2.08±0.21ab 1.75±0.12abc 2.12±0.23 0.95±0.08abcd 140.065＊＊cTnI/β-actin 0.27±0.02 0.29±0.01 1.28±0.12ab 0.92±0.12abc 1.26±0.11 0.61±0.05abcd 168.713＊＊

3 討論

3.1 BMSCs 的成功分離 近年來急性心肌梗死的發(fā)生率呈逐漸上升的趨勢(shì)，該病發(fā)生過程中會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞喪失，嚴(yán)重影響人類健康［7］。BMSCs 移植是一種可行的方法，其通過分化為心肌細(xì)胞來修復(fù)缺血心肌，從而逆轉(zhuǎn)心臟重塑、減輕心臟纖維化并改善心臟功能［8］。然而目前誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的效率較低，成為影響B(tài)MSCs 移植療效的因素之一［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)BMSCs 高表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD29、CD90、CD44，低表達(dá)CD34、CD45［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，第3代BMSCs細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，相鄰細(xì)胞間呈纖維細(xì)胞樣，且高表達(dá)CD29、CD90，低表達(dá)CD45，表明從大鼠中成功分離BMSCs。

3.2 過表達(dá)IGF2-AS 可以促進(jìn)BMSCs 心肌樣分化 lncRNA 是一類非編碼RNA，包含200多個(gè)核苷酸。其在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面調(diào)節(jié)基因表達(dá)，廣泛參與機(jī)體的生理與病理過程［11］。lncRNA IGF2-AS 是IGF2 的反義轉(zhuǎn)錄物，其通過調(diào)節(jié) miR-3、126-5p/KLK4 軸增 強(qiáng) BMSCs 的 成 骨 分化［12］；IGF2-AS在小鼠成肌細(xì)胞中高表達(dá)，并參與肌管的形成［13］，表明lncRNA IGF2-AS可參與細(xì)胞分化過程。但關(guān)于IGF2-AS 對(duì)BMSCs 心肌樣分化的影響尚不明確。Cx43 是心肌細(xì)胞中最常見的連接蛋白，其正常表達(dá)是心臟正常活動(dòng)及協(xié)調(diào)收縮與舒張的重要保證［14］。cTnT 在心肌組織中具有組織特異性，其高表達(dá)代表BMSCs已向心肌細(xì)胞分化［15］。在心肌收縮過程中，cTnI具有調(diào)節(jié)粗、細(xì)肌絲間的相對(duì)滑行的作用［16］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)IGF2-AS或 5-AZA 處理均可促進(jìn) BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI蛋白表達(dá)，且lncRNA IGF2-AS組細(xì)胞活力明顯高于5-AZA 組 ；沉 默 IGF2-AS 可抑 制 BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表達(dá)，表明 IGF2-AS 轉(zhuǎn)染或 5-AZA處理均可促進(jìn)BMSCs 心肌樣分化，且利用IGF2-AS轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞損傷更輕，效果更佳。

3.3 過表達(dá)lncRNA IGF2-AS 通過上調(diào)IGF2 促進(jìn)BMSCs心肌樣分化 IGF2是位于7號(hào)染色體上的印跡基因，其可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的分化［17］，在小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島樣細(xì)胞過程中高表達(dá)［18］，且可增強(qiáng)來自根尖乳頭的干細(xì)胞的成骨分化潛能［19］。本研究發(fā)現(xiàn)IGF2-AS 為IGF2 的反義轉(zhuǎn)錄本。有研究顯示，反義轉(zhuǎn)錄物可以調(diào)節(jié)其有義鏈基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯［20］。推測(cè) IGF2-AS 可能通過調(diào)控 IGF2 影響B(tài)MSCs 心肌樣分化。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究通過Western blot發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IGF2-AS可促進(jìn)IGF2蛋白表達(dá)，沉默IGF2-AS 可抑制IGF2 蛋白表達(dá)，表明IGF2-AS 可能正向調(diào)控IGF2 的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該假設(shè)，本研究利用RNA 下拉和RIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF2-AS能與IGF2蛋白相互作用，沉默IGF2逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)IGF2-AS 對(duì)BMSCs 心肌樣分化的促進(jìn)作用，最終證明了過表達(dá)lncRNA IGF2-AS 可通過上調(diào)IGF2促進(jìn)BMSCs心肌樣分化。因此，本研究為尋找高效誘導(dǎo)BMSCs 心肌樣分化的方法提供了新的思路。