勞基通 鄺希 劉惠 肖敏 陳永敏 廖小平 馬琳 李其富

癲癇是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病[1]，尤以顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)最常見，其多與海馬體區(qū)域的病變有關(guān)[2]。既往研究表明細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和整合素受體在癲癇發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用[3-4]。分泌型酸性富含半胱氨酸樣蛋白1型(secreted protein acidic and rich in cysteine1，SPARCL1)也稱Hevin，是一種由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的突觸蛋白，參與突觸重塑過程[5]。既往研究表明，SPARCL1在癲癇發(fā)作后表達(dá)明顯降低[6]。作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體的膜蛋白整合素β1(Integrinβ1)也被證實，敲除Integrinβ1基因后能誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)。然而，SPARCL1和Integrinβ1在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子機(jī)制尚未明確，因此本研究擬通過RT-qPCR和Western Blot方法檢測SE后第1周內(nèi)海馬及鄰近顳葉的皮層中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA及蛋白水平表達(dá)變化，初步探討兩者在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：選用鼠齡21 d雄性SD大鼠共56只，體重為60～80 g，購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，于室溫20～25℃、濕度50%～70%SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，每籠5只，12 h光照，自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.1.2主要試劑和儀器：硫酸阿托品(上海禾豐制藥有限公司)和氯化鋰-匹羅卡品(LiCl-PILO；購于美國Sigma公司)。兔抗SPARCL1抗體、兔抗Integrinβ1抗體、兔抗GAPDH抗體(內(nèi)參抗體)、山羊抗兔IgG抗體(HRP)均購于中國博奧森生物有限公司。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購于中國Beyotime公司。TRIzol Reagent(Life)，HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix(中國諾唯贊生物科技股份有限公司)，β-Actin基因作為內(nèi)參基因，引物均由華大基因公司合成。SDS-PAGE蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(中國天能公司)，熒光定量PCR儀MX3005P(中國安捷倫科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1LiCl-PILO急性大鼠模型的建立：56只大鼠隨機(jī)分為致癇組(35只)和對照組(21只)。致癇組大鼠按體重127 mg/kg予氯化鋰(LiCl)腹腔注射；20 h后按體重1 mg/kg予阿托品腹腔注射；間隔30 min后，按體重50 mg/kg腹腔注射匹羅卡品(PILO)，注射后5 h內(nèi)觀察大鼠的癇性發(fā)作并進(jìn)行分級。發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)按照動物癇性發(fā)作Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[8]：0級：無抽搐發(fā)作；Ⅰ級：咀嚼、面部抽搐；Ⅱ級：點(diǎn)頭樣動作和孤立性肌陣攣；Ⅲ級：單側(cè)前肢陣攣、抽搐樣動作；Ⅳ級：全身性強(qiáng)直陣攣抽搐，伴站立；Ⅴ級：全身性強(qiáng)直陣攣抽搐伴站立跌倒，跳躍、持續(xù)性陣攣發(fā)作或抽搐致死。癲癇發(fā)作未達(dá)Ⅳ級者，按體重15 mg/kg追加PILO直至完全點(diǎn)燃出現(xiàn)癲癇發(fā)作。以癲癇發(fā)作時間點(diǎn)為起點(diǎn)，根據(jù)癲癇發(fā)作后時間分別于3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d及7 d等時間點(diǎn)選取大鼠，分為7個亞組，每亞組5只。為保證致癇組中大鼠存活時間，觀察期間按體重10 mg/kg予腹腔注射地西泮。對照組操作相同，以同體積生理鹽水替代LiCl和PILO腹腔注射，按相應(yīng)時間點(diǎn)分為7個亞組，每亞組3只。

1.2.2動物標(biāo)本的處理：致癇組和對照組各亞組大鼠均于相應(yīng)時間點(diǎn)按體重4 mL/kg腹腔注射10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛，麻醉后快速斷頭取腦，并迅速在冰上剝離出雙側(cè)大腦半球海馬組織和鄰近顳葉皮層組織，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測腦組織SPARCL1和Integrinβ1的mRNA表達(dá)水平：用TRIzol Reagent提取各組織樣本的總mRNA，用HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)將獲得的mRNA分別反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用ChamQ SYBR qPCR Master Mix對獲得的cDNA進(jìn)行qPCR實驗，以β-Actin作為內(nèi)參，分別檢測各組織樣本中SPARCL1 mRNA和Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平。SPARCL1、Integrinβ1和β-Actin基因引物信息見表1。

表1 SPARCL1、Integrinβ1和β-Actin基因引物信息

1.2.4蛋白免疫印跡雜交(Western blot)法檢測SPARCL1和Integrinβ1蛋白表達(dá)水平：將凍于 -80℃冰箱的海馬組織和顳葉皮層組織取出充分研磨，加入2%(質(zhì)量濃度)SDS裂解液，混勻，室溫裂解10 min，13 000g常溫離心10 min，取上清液(即為蛋白裂解液)；采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)法測定對應(yīng)樣品蛋白濃度，配平濃度后，將蛋白煮沸變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；5%(質(zhì)量濃度)脫脂牛奶室溫下封閉2 h，然后與SPARCL1一抗、Integrinβ1一抗及GAPDH一抗反應(yīng)，4℃搖床過夜；二抗室溫孵育 90 min。每步驟間用TBST洗3次，每次10 min，ECL室溫顯色，凝膠成像儀曝光成像。采用Image J軟件分析各個條帶的灰度值，并以其與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示該樣品目的蛋白的表達(dá)量，分別計算出各組SPARCL1和Integrin β1的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA followed by Tukey HSD post hoc test)，多組間兩兩比較采用Tukey’s方法。SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠行為學(xué)觀察致癇組大鼠予PILO腹腔注射5～15 min 后，大鼠初表現(xiàn)為立毛、流涎、顫抖和結(jié)膜充血等，同時或先后出現(xiàn)癇性發(fā)作，如凝視不動、咀嚼、濕狗樣震顫、頭頸上仰，后發(fā)展為面肌抽搐、點(diǎn)頭、反復(fù)雙側(cè)前肢陣攣、伴直立、跌倒或翻轉(zhuǎn)、肢體和尾部強(qiáng)直等癲癇狀態(tài)。以上狀態(tài)維持1 h，發(fā)作間期完全停止，可正?；顒?。對照組大鼠實驗期間均行為活動正常，均未有癲癇發(fā)作。

2.2 致癇組及對照組大鼠海馬組織和顳葉皮層中SPARCL1和Integrinβ1表達(dá)水平比較對照組7個亞組大鼠海馬組織和顳葉皮層中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，故后續(xù)實驗中均僅設(shè)1個對照組。

2.2.1兩組海馬組織SPARCL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：具體結(jié)果見表2、圖1。致癇組3 h組、6 h組、12 h組和1 d組海馬組織中SPARCL1 mRNA表達(dá)水平均較對照組下降(P<0.05)，致癇組2 d組、3 d組、7 d組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且2 d組、3 d組和7 d組的SPARCL1 mRNA水平均高于3 h組、6 h組、12 h組和1 d組(P<0.05)，致癇組3 h組、6 h組、12 h組和1 d組組間，以及致癇組2 d組、3 d組和7 d組組間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩組大鼠海馬組織中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表達(dá)情況

注：3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d：分別為致癇組中相應(yīng)時間亞組;SPARCL1：分泌型酸性富含半胱氨酸樣蛋白1型；Integrinβ1：整合素β1；GADPH：內(nèi)參 圖 1 兩組大鼠不同時間點(diǎn)海馬組織中SPARCL1蛋白和Integrinβ1蛋白表達(dá)情況(Western blot)

致癇組6 h組、12 h組、1 d組和2 d組海馬組織中SPARCL1蛋白水平均低于對照組(P<0.05或P<0.01)，3 h組、3 d組、7 d組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且致癇組6 h組、12 h組、1 d組和2 d組低于致癇組3 h組(P<0.05)；致癇組6 h組、12 h組、1 d組和2 d組間比較，3 d組和7 d組組間比較，分別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且致癇組3 d組和7 d組SPARCL1蛋白水平均低于3 h組。由上述結(jié)果推測，大鼠在癲癇發(fā)作后3 h至7 d內(nèi)，大鼠海馬組織中的SPARCL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)先下降再恢復(fù)的趨勢。其中，SPARCL1 mRNA表達(dá)從2 d開始恢復(fù)正常，SPARCL1蛋白表達(dá)水平從3 d開始恢復(fù)正常。

2.2.2兩組海馬組織Integrinβ1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：與對照組相比，致癇組3 h組和6 h組海馬組織的Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，致癇組1 d組和2 d組顯著增加(P<0.01)，其他各時間組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與致癇組3 h組、6 h組比較，致癇組12 h組、1 d組、2 d組、3 d組、7 d組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與致癇組12 h組比較，致癇組1 d組、2 d組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)，致癇3 d、7 d組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組1 d組、2 d組比較，致癇3 d、7 d組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)。

與對照組比較，致癇組6 h、12 h組海馬組織的Integrinβ1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，致癇組3 d、7d組表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01)，致癇組3 h組、1 d組、2 d組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與致癇組3 h組比較，致癇2 d、3 d、7 d組Integrinβ1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與致癇組6 h組比較，致癇組1 d、2 d、3 d、7 d組Integrinβ1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與致癇組12 h組、1 d組比較，致癇2 d、3 d、7 d組Integrinβ1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與致癇組2 d、3 d組比較，致癇7 d組Integrinβ1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。

由此可見，在癲癇發(fā)作后的大鼠海馬組織中的Integrinβ1 mRNA水平最初會出現(xiàn)下降，且在12 h后逐漸恢復(fù)甚至高于對照組。Integrinβ1蛋白水平在最初的12 h內(nèi)會逐漸降低，此后則逐漸恢復(fù)甚至高于正常對照組。具體結(jié)果見表2、圖1。

2.2.3兩組顳葉皮層組織SPARCL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：與對照組比較，致癇組3 h組、6 h組和7 d組大鼠顳葉皮層中SPARCL1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，致癇組12 h組和1 d組則明顯下降(P<0.01)，2 d組和3 d組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與致癇組3 h組比較，致癇組6 h組、7 d組大鼠顳葉皮層SPARCL1 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組3 h組、6h組比較，致癇組12 h組、1 d組、2 d組、3 d組SPARCL1 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組12 h組、1 d組比較，致癇組2 d組、7 d組SPARCL1 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組2 d組、3 d組比較，致癇7 d組SPARCL1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。

致癇組12 h組、1 d組、2 d組、3 d組和7 d組SPARCL1蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)，致癇組3 h組、6 h組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與致癇組3 h組、6 h組比較，致癇組12 h組、1 d組、3 d組、7 d組SPARCL1蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)；與致癇組12 h組、1 d組、2 d組比較，致癇3 d、7 d組SPARCL1蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組3 d組比較，致癇7 d組SPARCL1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。

由上述結(jié)果可見，在癲癇發(fā)作后，大鼠顳葉皮層中SPARCL1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，SPARCL1 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)前期上升后下調(diào)的波動趨勢。具體結(jié)果見表3、圖2。

表3 兩組顳葉皮層組織中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表達(dá)情況

注：3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d：分別為致癇組中相應(yīng)時間亞組；SPARCL1：分泌型酸性富含半胱氨酸樣蛋白1型；Integrinβ1：整合素β1；GADPH：內(nèi)參 圖 2 兩組大鼠不同時間點(diǎn)顳葉皮層組織中SPARCL1蛋白和Integrinβ1蛋白表達(dá)情況(Western blot)

2.2.4兩組顳葉皮層組織Integrinβ1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：與對照組相比，致癇組3 h組、6 h組和7 d組大鼠顳葉皮層Integrinβ1 mRNA顯著增加(P<0.01)，其他組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

與致癇組3 h組比較，致癇組6 h組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)。與致癇組3 h組、6 h組比較，致癇組12 h組、1 d組、2 d組、3 d組、7 d組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組12 h組、1 d組、3 d組比較，致癇7 d組Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平均上升(P<0.05)。

與對照組比較，除致癇組3 h組外，致癇組6 h組、12 h組、1 d組、2 d組、3 d組、7 d組大鼠顳葉皮層Integrinβ1蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與致癇組3 h組、6 h組、12 h組、1 d組、2 d組比較，致癇3 d、7 d組Integrinβ1蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)。與致癇組3 d組比較，致癇7 d組Integrinβ1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。

由此可見，在癲癇發(fā)作后的大鼠海馬組織中的Integrinβ1 mRNA水平最初會升高，且在12 h后逐漸恢復(fù)甚至高于對照組；Integrinβ1蛋白水平呈現(xiàn)下降趨勢。具體結(jié)果見表3和圖2。

2.3SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析致癇組大鼠海馬組織中SPARCL1 mRNA和Integrinβ1 mRNA兩者表達(dá)水平成正相關(guān)(r=0.684，P<0.01)，SPARCL1和Integrinβ1蛋白表達(dá)水平亦成正相關(guān)(r=0.724，P<0.01)；顳葉皮層組織中SPARCL1 mRNA和Integrinβ1 mRNA兩者表達(dá)水平成正相關(guān)(r=0.908，P<0.01)，SPARCL1和Integrinβ1蛋白表達(dá)水平成正相關(guān)(r=0.852，P<0.01)。

3 討論

癲癇是一種由于大腦神經(jīng)元異常放電引起的以重復(fù)的自發(fā)性發(fā)作為顯著特征的常見慢性腦病[1]。癲癇的發(fā)作能夠擴(kuò)散到大腦皮層，導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)過度興奮，與突觸激發(fā)和突觸抑制之間的不平衡密切相關(guān)[9]。

ECM是指細(xì)胞分泌的細(xì)胞外分子的集合，由兩蛋白多糖和纖維蛋白(如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層黏連蛋白)組成。ECM在組織形態(tài)發(fā)生、分化和體內(nèi)平衡中發(fā)揮了重要的作用[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，海馬中ECM分子如層黏連蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9等的變化而導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境的黏附狀態(tài)改變是癲癇發(fā)作活動的重要變化[11-12]，提示調(diào)節(jié)黏附的ECM分子可能在癲癇發(fā)作中參與突觸重塑的過程。

SPARCL1 是一種由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的突觸蛋白，通過與突觸黏附蛋白相互作用來調(diào)節(jié)發(fā)育中大腦中谷氨酸能突觸的形成[5]。既往研究表明，LiCl-PILO誘導(dǎo)的癲癇大鼠SE后，SPARCL1參與癲癇發(fā)生的突觸修飾[13]?？偠灾琒PARCL1在重建與發(fā)育生長相關(guān)的事件及LiCl-PILO誘導(dǎo)的SE后大腦突觸重塑中發(fā)揮作用。Lively等[14]研究顯示，SPARCL1在LiCl-PILO誘導(dǎo)的癲癇大鼠中的表達(dá)存在空間動態(tài)變化，主要表現(xiàn)在SE后1天內(nèi)海馬SPARCL1蛋白表達(dá)水平均顯著下降，而之后逐漸升高，至第7天返回正常水平，提示SPARCL1蛋白可能參與癲癇的發(fā)生過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，SPARCL1在海馬CA2區(qū)的錐體細(xì)胞中沒有變化，而在CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)瞬時增強(qiáng)的SPARCL1信號，但錐體細(xì)胞中的表達(dá)降低[14]。這表明，觀察到的SPARCL1動態(tài)變化可能與DG區(qū)錐形細(xì)胞中SPARCL1的減少相關(guān)[15]。

整合素是α-β-異二聚體跨膜糖蛋白受體，整合素家族及其配體在調(diào)節(jié)神經(jīng)元連接的相關(guān)過程(包括神經(jīng)突生長、突觸的形成和維持以及突觸可塑性)的控制中發(fā)揮重要作用[4]。Pinkstaff等[16]發(fā)現(xiàn)在幼稚大鼠中海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞Integrinβ1 mRNA表達(dá)水平很低，Robel等[17]研究表明整合素參與癲癇發(fā)作后的生理變化過程，尤其在調(diào)節(jié)神經(jīng)元環(huán)路興奮性和星型膠質(zhì)細(xì)胞功能中并發(fā)揮了重要的作用。如一項哺乳動物研究顯示，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中敲除Integrinβ1基因后能夠誘導(dǎo)自發(fā)性癲癇發(fā)作[7]。Pinkstaff等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在LiCl-PILO建立的癲癇大鼠模型中，Integrinβ1在癲癇超急性期中先降低之后再升高。 此外，Gall等[18]和Venstrom等[19]認(rèn)為，在癲癇發(fā)作期Integrinβ1蛋白表達(dá)增加，并且與神經(jīng)突向外生長過程有關(guān)。

目前常用LiCl-PILO建立癲癇動物模型以研究癲癇致病機(jī)制[1]。LiCl-PILO能夠誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)難治性內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的急性期(1 d)、靜止期(1周)和SRS自發(fā)發(fā)作期(30 d后)。因此，能夠全面動態(tài)地觀察難治性內(nèi)側(cè)顳葉癲癇形成的全過程。難治性顳葉癲癇臨床發(fā)作復(fù)雜，治療效果差，通過深入研究，不斷了解顳葉癲癇發(fā)作的病理生理過程，選擇多靶點(diǎn)聯(lián)合藥物治療，減少癲癇發(fā)作次數(shù)，減輕患者痛苦。本研究通過應(yīng)用該方法建立大鼠癲癇模型，分別在SE后的急性期和靜止期觀察致癇大鼠的海馬和皮層組織中SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示致癇大鼠急性期SPARCL1和Integrinβ1的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，靜止期表達(dá)回落，且二者的表達(dá)水平存在正相關(guān)，提示SPARCL1和Integrinβ1二者很可能在癲癇發(fā)生早期具有重要作用，且二者在癲癇發(fā)作急性期和靜止期內(nèi)可能存在相互作用。然而二者在自發(fā)發(fā)作期的表達(dá)及其相互作用關(guān)系仍需進(jìn)行后續(xù)研究。本研究表明二者在海馬和皮層隨著癲癇發(fā)生的時間變化出現(xiàn)表達(dá)差異，但其詳細(xì)作用機(jī)制及是否存在多種分子相互調(diào)節(jié)，臨床檢測該指標(biāo)能否早期識別癲癇發(fā)生過程，仍需要為進(jìn)一步研究闡明。

綜上，本研究提示SPARCL1和Integrinβ1在癲癇大鼠海馬和鄰近顳葉皮層中存在癲癇發(fā)作后的動態(tài)表達(dá)變化，且二者的表達(dá)變化趨勢成正相關(guān)。