林艷艷，邢子偉，倫雪恩，劉梓航，謝英俊，譚翰清★

（1.肇慶市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，廣東 肇慶 526020；2.肇慶市疾病預(yù)防控制中心，廣東 肇慶 526060；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三臨床學(xué)院，廣東 廣州 510150；4.廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510150；5.廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510150）

呼吸道病毒是一類致病性病原微生物，主要通過飛沫、直接接觸等途徑傳播。進(jìn)行核酸檢測是我國防控呼吸道病毒傳播的重要手段，而檢測過程中的生物安全問題需要重點(diǎn)關(guān)注[1-2]。采用滅活型病毒保存管保存呼吸道病毒并對其實(shí)施滅活前處理，可進(jìn)一步降低檢測過程中檢測人員感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測的安全性。本研究探討保存液類型及56℃滅活前處理30 ～60 min 對經(jīng)磁珠法提取的呼吸道病毒熒光PCR 檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7500fast 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（由美國ABI 公司生產(chǎn)）、AUTO-PURE 32A 核酸提取儀（由杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)）。磁珠法核酸提取試劑（由重慶中元生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、呼吸道病毒核酸檢測試劑盒（由上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)）。含胍鹽的滅活型病毒保存管（由山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司生產(chǎn)）、非滅活型病毒保存管（由意大利COPAN 公司生產(chǎn)）。陽性質(zhì)控品為廣東省疾病預(yù)防控制中心提供的滅活型考核樣本。

1.2 方法

1.2.1 模擬臨床樣本的制備、前處理和核酸提取將呼吸道病毒質(zhì)控品（原始Ct 值約為21）10 倍稀釋為5 個(gè)梯度，稀釋基質(zhì)分別為兩種類型樣本管的保存液（非滅活型病毒保存液和含有胍鹽的滅活型病毒保存液）。分別取10-2、10-3、10-4稀釋梯度的滅活型和非滅活型保存管模擬樣本各5 管，在常溫和56℃下于不同時(shí)間段進(jìn)行存放和滅活前處理，其中1 管在室溫下放置，另外4 管分別在56℃下處理30 min、40 min、50 min、60 min后取出。各取200 μL 樣本應(yīng)用預(yù)分裝磁珠法核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA 提取。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測 呼吸道病毒核酸檢測體系總體積為25 μL，核酸模板加載量為5 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)程序設(shè)置：50 ℃逆轉(zhuǎn) 錄10 min ；95 ℃滅 活5 min ；95 ℃變 性10 s，55℃變性40 s（末端收集熒光），共45 個(gè)循環(huán)。ORF1ab 選擇“FAM”通道，N 基因選擇“VIC”通道，人源內(nèi)參基因選擇“ROX”通道。在陰性、陽性對照結(jié)果均成立的條件下進(jìn)行結(jié)果判定，樣本雙靶標(biāo)有“S”型擴(kuò)增曲線則判定為陽性，調(diào)整閾值和基線并記錄Ct 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0 軟件分別對ORF1ab、N 基因Ct 值進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，比較兩種病毒保存液在常溫和56℃下經(jīng)不同時(shí)間的滅活前處理后對呼吸道病毒熒光PCR 檢測結(jié)果Ct 值的影響。

2 結(jié)果

2.1 兩種病毒保存液及經(jīng)56℃滅活前處理對呼吸道病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測結(jié)果的影響

兩種病毒保存液（非滅活型病毒保存液和含有胍鹽的滅活型病毒保存液）模擬樣本在56℃下進(jìn)行不同時(shí)間的滅活前處理，以常溫組為對照，結(jié)果顯示10-2、10-3、10-4 稀釋梯度滅活型保存液模擬樣本的ORF1ab/N 雙靶基因均擴(kuò)增陽性，呈“S”型曲線，各稀釋度ORF1ab 靶基因的平均Ct 值依次為26.95、30.56、33.70 ；N 靶基因的平均Ct 值依次為28.80、32.26、35.50。非滅活型保存液的模擬樣本10-2、10-3、10-4 稀釋梯度ORF1ab 靶基因均擴(kuò)增陽性，呈“S”型曲線，平均Ct 值依次為28.64、32.21、36.39 ；非滅活型保存液的模擬樣本10-2、10-3 稀釋梯度N 基因均全部擴(kuò)增，10-4 稀釋梯度在常溫和56℃、50 min處理的平行樣中有一個(gè)無擴(kuò)增，N 靶基因的平均Ct 值依次為30.13、33.31、36.48。從擴(kuò)增圖效果來看，滅活型保存液樣本比非滅活型保存液的Ct 靠前，相對熒光強(qiáng)度也較高。詳見圖1、圖2。

圖1A 10-2、10-3、10-4 稀釋度滅活型保存液模擬樣本核酸檢測N 基因擴(kuò)增結(jié)果

圖1B 10-2、10-3、10-4 稀釋度非滅活型保存液模擬樣本核酸檢測N 基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2C 10-2、10-3、10-4 稀釋度滅活型保存液模擬樣本核酸檢測ORF1ab 基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2D 10-2、10-3、10-4 稀釋度非滅活型保存液模擬樣本核酸檢測ORF1ab 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

采用配對樣本t檢驗(yàn)判斷兩種類型的病毒保存液對Ct 值的影響，結(jié)果顯示兩種病毒保存液經(jīng)磁珠法提取核酸后，呼吸道病毒核酸檢測Ct 值的配對t檢驗(yàn)結(jié)果相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。詳見表1。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析判斷兩種類型的病毒保存液對常溫、56℃滅活30 ～60 min前處理呼吸道病毒核酸檢測組內(nèi)Ct 值的影響，結(jié)果顯示滅活時(shí)間對組內(nèi)的Ct 值無影響（P＞0.05）。詳見表2。

表1 兩種類型病毒保存液呼吸道病毒核酸檢測組內(nèi)Ct 值結(jié)果的配對t 檢驗(yàn)

表2 兩種類型病毒保存液對常溫、56℃滅活30 ～60 min 前處理呼吸道病毒核酸檢測組內(nèi)Ct 值隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析

3 討論

呼吸道病毒在全球范圍內(nèi)的流行形勢嚴(yán)峻，國內(nèi)外防控呼吸道病毒傳播的效果有著較大的差別[3]。國內(nèi)防控呼吸道病毒傳播的經(jīng)驗(yàn)是積極落實(shí)“五早”策略（包括防控疫情早報(bào)告、防控監(jiān)督早到位、防護(hù)用品早準(zhǔn)備、防控措施早落實(shí)、防控輿情早處置），通過核酸檢測網(wǎng)絡(luò)，在早期檢測發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒傳染源后，立即進(jìn)行隔離、流調(diào)、救治，嚴(yán)格控制傳染源，切斷病毒的傳播途徑[4-6]。核酸檢測在呼吸道病毒防控工作中的作用重大，且對檢測結(jié)果質(zhì)量的要求較高。影響核酸檢測結(jié)果質(zhì)量的因素主要有采樣因素、樣本保存因素、提取效果因素、擴(kuò)增試劑質(zhì)量準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性因素及病毒株變異因素等。在技術(shù)環(huán)節(jié)，由于rRTPCR 技術(shù)較為成熟、適配的熒光PCR 儀較為普及且性能穩(wěn)定可靠，因此該技術(shù)成為目前呼吸道病毒檢測中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)[7]。呼吸道病毒可通過飛沫傳播、直接接觸傳播及密閉空間內(nèi)氣溶膠傳播等，其傳染性和傳播力較強(qiáng)[8]。研究指出，在對呼吸道病毒進(jìn)行檢測時(shí)，為了降低檢測人員感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)選擇使用含胍鹽滅活劑保存液的采樣管保存樣本[9]。對于實(shí)驗(yàn)室來說，樣本保存及前處理因素是可控的，但需要評(píng)估使用滅活型保存管是否會(huì)對熒光PCR 檢測結(jié)果造成影響。本研究中對三個(gè)稀釋度的非滅活型和滅活型模擬樣本進(jìn)行檢測的結(jié)果顯示，滅活型保存管內(nèi)的樣本比非滅活型保存管內(nèi)的樣本擴(kuò)增效果更好，Ct 值更靠前，擴(kuò)增曲線更高，體現(xiàn)出更好的線性。特別是對于低濃度的樣本，采用滅活型保存管保存后檢測的效果更好。究其原因可能是，滅活型保存管中含有的胍鹽（如異硫氰酸胍）可滅活RNA 酶，使核酸分解減少，增強(qiáng)裂解液對病毒的裂解效果[9-10]。對呼吸道病毒感染患者進(jìn)行采樣的過程中，患者受到刺激后出現(xiàn)的噴濺反應(yīng)可增加外在污染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，若消毒不規(guī)范，可給保存管外表面、保存袋表面等帶來潛在的安全隱患。實(shí)驗(yàn)室收到樣本后進(jìn)行滅活前處理，可消滅包裝袋及保存管外表面的病毒，降低檢測人員感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究中三個(gè)稀釋度模擬滅活型樣本在56℃下經(jīng)30 min、40 min、50 min、60 min 的處理與常溫下處理的結(jié)果相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這說明在56℃下進(jìn)行滅活前處理對于RNA 的降解不會(huì)產(chǎn)生影響。究其原因可能是胍鹽能將RNA 酶滅活，增強(qiáng)了核酸保存的穩(wěn)定性。由此可見，在56℃下進(jìn)行滅活前處理可有效降低呼吸道病毒的傳染性，且對檢測結(jié)果無影響[11]。

綜上所述，含胍鹽的滅活型病毒保存液可提高經(jīng)磁珠法提取的呼吸道病毒熒光PCR 檢測結(jié)果的靈敏度，56℃滅活前處理30 ～60 min 未對經(jīng)磁珠法提取的呼吸道病毒熒光PCR 檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。