華敏敏， 施惠娟， 茹彥飛

(1)上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院，國家衛(wèi)生健康委員會計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)， 上海 200032； 2)西湖大學(xué)生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)浙江省實(shí)驗(yàn)室，浙江省結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省生長調(diào)控和轉(zhuǎn)化研究 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院， 杭州 310024)

精子是一類高度特異化的細(xì)胞，它的發(fā)育起始于睪丸中的原始生殖細(xì)胞，經(jīng)歷一系列復(fù)雜的精子發(fā)生過程，最終在附睪中發(fā)育為成熟精子。成熟精子經(jīng)由受精過程與卵子結(jié)合，在將父源性的遺傳信息傳遞給子代的同時(shí)，還會傳遞大量的表觀遺傳信息，包括DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA等，這些信息的改變并不依賴于DNA序列的變化。表觀遺傳信息與遺傳信息一起，共同參與了受精過程及早期胚胎的發(fā)育，并可能最終影響子代的健康[1-4]。

依據(jù)已有的發(fā)育生物學(xué)及流行病學(xué)數(shù)據(jù)，環(huán)境因素可能是影響子代健康的重要因素[5]。從蠕蟲到哺乳動物，包括人類，親本的生活環(huán)境可影響子代的健康[6, 7]。Anway等[8]最先證明，對孕期大鼠進(jìn)行環(huán)境因素——內(nèi)分泌干擾物(vinclozolin)——的暴露可導(dǎo)致子代雄性大鼠睪丸DNA甲基化水平發(fā)生改變，同時(shí)引起精子質(zhì)量的下降，且這些改變可持續(xù)至F4代。另有在人群樣本中研究發(fā)現(xiàn)，吸煙以及營養(yǎng)狀況的改變可導(dǎo)致可遺傳的健康變化。例如，子代較易出現(xiàn)糖尿病和心血管疾病等[9, 10]。此外，來自不同實(shí)驗(yàn)室的研究均表明，環(huán)境暴露包括高脂飲食(high fat diet, HFD)[1, 11]、低蛋白飲食(low protein diet, LPD)[4]和心理壓力[12, 13]等，可引起父代表型變化，并可通過父代生殖系統(tǒng)以非孟德爾遺傳的方式傳遞給后代。以上結(jié)果均提示，環(huán)境暴露可能引起親本生殖細(xì)胞(精子或卵子)表觀遺傳信息的變化，從而影響自身的發(fā)育與健康。雖然這種環(huán)境暴露不直接作用于子代，但其產(chǎn)生的獲得性性狀可通過生殖細(xì)胞傳遞給子代，同時(shí)對子代的健康產(chǎn)生影響，這種現(xiàn)象即被稱為跨代遺傳[14, 15]。

對于哺乳動物而言，遺傳是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，從雄性表觀遺傳學(xué)角度，驗(yàn)證跨代遺傳有一定的挑戰(zhàn)性：首先，配子經(jīng)過表觀遺傳重編程，并通過受精過程，實(shí)現(xiàn)表觀遺傳信息的傳遞。其次，血睪屏障的存在阻礙了體細(xì)胞與生殖細(xì)胞之間的生物信息交流(乃至子代)。此外，由于精子和卵子的體積相差懸殊，傳統(tǒng)的遺傳觀點(diǎn)認(rèn)為，與母系相比，父系對子代的貢獻(xiàn)較為有限。但雌性環(huán)境暴露研究中遇到的困難在于，難以區(qū)分環(huán)境因素作用的對象是卵子還是胚胎[16]。相比之下，雄性環(huán)境暴露則相對簡單，主要通過精子影響子代。因此是研究跨代遺傳相關(guān)機(jī)制的較為理想的模型[17]。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，許多新陳代謝相關(guān)疾病(例如糖尿病)既與遺傳相關(guān)，也與患者的生活方式及環(huán)境相關(guān)，僅部分與遺傳變異相關(guān)。但越來越多的研究證實(shí)，表觀遺傳在其中發(fā)揮一定的作用。因此，理解跨代遺傳的可能機(jī)制，可為研究人類相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。本綜述主要討論哺乳動物中的雄性相關(guān)的跨代遺傳，并重點(diǎn)探討精子小非編碼RNAs(small noncoding RNAs, sncRNAs)作為表觀遺傳調(diào)控因子，在跨代遺傳中的可能機(jī)制。

1 雄性環(huán)境暴露相關(guān)的跨代遺傳

親代經(jīng)歷的特定環(huán)境暴露可影響子代健康。該現(xiàn)象最早是通過人群中的流行病學(xué)調(diào)查得出的。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，1944～1955年間荷蘭大饑荒時(shí)期，母親在懷孕期間遭受饑餓可導(dǎo)致孩子新陳代謝相關(guān)疾病的比例顯著增加[18]。男性方面，2006年P(guān)embrey等[10]研究發(fā)現(xiàn)，父親若有早年吸煙史，其兒子青少年時(shí)期的身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)較高。對來自瑞典Overkalix地區(qū)的人群進(jìn)行連續(xù)3代觀察的研究顯示，祖父的飲食習(xí)慣與其孫輩的健康狀況及其死亡率相關(guān)[9]。

大量動物實(shí)驗(yàn)同樣表明，父代環(huán)境暴露可影響子代表型。在飲食相關(guān)暴露中，父代高脂飲食(high fat diet，HFD)將導(dǎo)致F1代雌鼠葡萄糖不耐受[19]。父代低蛋白飲食(low protein diet，10vs.19 %蛋白質(zhì)飲食，根據(jù)體重計(jì)算)會導(dǎo)致子代肝中膽固醇合成異常[20]。對雄鼠在交配前進(jìn)行饑餓處理，將導(dǎo)致其子代血糖水平降低[21]。還有研究顯示，父代的心理壓力會提高子代的壓力敏感性，同時(shí)子代皮質(zhì)醇水平及葡萄糖代謝出現(xiàn)異常[6, 12, 22]。近幾年，也有許多關(guān)于毒性物質(zhì)暴露的相關(guān)研究。例如，在四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)導(dǎo)致雄性大鼠肝損傷的模型中，其子代肝臟的成纖維細(xì)胞減少[7]；若對雄性小鼠進(jìn)行乙酰苯氣味暴露，其所產(chǎn)子代同樣會對該物質(zhì)敏感[23]；父代尼古丁暴露后，子代對尼古丁以及其他有毒物質(zhì)(例如可卡因)的代謝耐受提高[24]。同時(shí)，子代肝臟中多個(gè)與有毒物質(zhì)清除相關(guān)的基因表達(dá)水平升高，且子代對毒性物質(zhì)的耐受表型將不僅僅局限于尼古丁相關(guān)，而是廣譜耐受。值得注意的是，在大多數(shù)研究中，父代環(huán)境暴露相關(guān)的跨代遺傳表現(xiàn)為子代對疾病的敏感性升高。

2 精子傳遞表觀遺傳信息

精子核具有高度壓縮的致密結(jié)構(gòu)，體積約為普通體細(xì)胞的1/6。隨著受精過程的完成，父代表觀遺傳信息可通過精子傳遞至受精卵，乃至子代[17]。在這個(gè)漫長的過程中，組蛋白被魚精蛋白替換，精子細(xì)胞DNA本身及其相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生了表觀遺傳修飾。例如，DNA甲基化、組蛋白修飾，以及sncRNAs調(diào)控等。它們共同作用，改變了精子中的表觀遺傳信息，在精子染色質(zhì)重塑、合子、胚胎、胎兒乃至子代的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

目前，關(guān)于“精子傳遞表觀遺傳”的觀點(diǎn)尚存在爭議，主要是因?yàn)楹献优c原始生殖細(xì)胞(primary germ cell, PGC)中存在表觀遺傳重編程。這其中，包括2個(gè)獨(dú)立的階段：從PGCs發(fā)育至胚胎性腺(E10.5-E12.5)，以及受精后的合子到胚胎植入前的桑椹胚階段。該過程可擦除大部分環(huán)境暴露所產(chǎn)生的表觀遺傳標(biāo)記。DNA甲基化產(chǎn)生的m5C，由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化，可通過脫氨基或是羥基化作用，實(shí)現(xiàn)脫甲基化[25]。有研究表明，環(huán)境暴露后，精子DNA甲基化的類型發(fā)生變化，但這些DNA甲基化的改變在其后代中檢測不到[26]。表觀遺傳重編程還包括組蛋白修飾的擦除，在精子形成過程中，組蛋白H4高度乙?；癁榻M蛋白被魚精蛋白替換提供基礎(chǔ)；同時(shí)，這種重編程對維持精子功能至關(guān)重要。有研究表明，線蟲中的H3K4me2去甲基化酶LSD1/KDM1對組蛋白的作用，可避免將錯(cuò)誤的信息傳遞給后代[27]。此外，值得注意的是印跡基因的保留，意即其在受精后可逃逸重編程，并將特定的父代表型，以及異常的甲基化印跡通過精子傳遞給子代，這些印跡基因?qū)ε咛ゼ捌浣M織器官的發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響[28]。一項(xiàng)關(guān)于輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies, ART)的研究表明，不育(尤其是少精癥)患者的精子，在ART治療過程中可將印跡基因錯(cuò)誤地傳遞給子代，并導(dǎo)致后代的健康風(fēng)險(xiǎn)升高[29]。以上研究結(jié)果提示，精子中可能存在表觀遺傳信息的傳遞，能夠逃脫表觀遺傳重編程，參與跨代遺傳。近年來，關(guān)于精子sncRNAs在哺乳動物跨代遺傳中的研究越來越多，提示它們或許會作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子參與其中。本綜述主要就該部分內(nèi)容展開討論。

2.1 精子小非編碼RNAs

sncRNAs，長度< 50 nt，是調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳因子之一，可以通過與翻譯機(jī)器相互作用和/或通過降解其靶mRNA(message RNA)發(fā)揮功能。隨著實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)的發(fā)展，例如高通量技術(shù)及RNA測序技術(shù)(RNA sequencing, RNA-seq)，人們在哺乳動物成熟精子中發(fā)現(xiàn)及鑒定到大量精子sncRNAs，主要為tRNA來源的小RNAs(transfer RNA-derived small RNAs，tsRNAs，也被稱為tRFs，tRNA fragments)，其次為rRNA來源的小RNAs(risbosome-RNA derived small RNAs, rsRNAs)與微RNA(microRNAs, miRNAs)，及PIWI蛋白相互作用RNAs(PIWI-interacting small RNAs, piRNAs)等[30-33]。

精子sncRNAs重要成員之一是tRNA來源的小RNAs，或被稱為tRNA fragments(tRFs)(29～34 nt)，主要來源于成熟tRNA或是pre-tRNA的5′-端，在許多細(xì)胞類型中均有表達(dá)，在精子細(xì)胞中表達(dá)尤其豐富[1, 4, 30, 31]。通過小鼠精子RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，它在成熟精子中表達(dá)比例最高，是成熟精子sncRNAs的主要組分，但是目前其功能尚不十分明確[31]。在其他哺乳動物(例如人類與大鼠)成熟精子中，同樣表達(dá)大量tsRNAs[34]。tsRNAs可根據(jù)其在tRNAs的來源分為5類[35]：5′-tRNA halves、3′-tRNA halves、5′-tRFs(tRNA-derived RNA fragment)、i-tRFs(internal tRFs)及3′-tRFs。tsRNAs最初被認(rèn)為是tRNAs的隨機(jī)降解產(chǎn)物。最近的研究顯示，tsRNAs的生成是被高度調(diào)控的過程，具有一定的位點(diǎn)特異性，在某些細(xì)胞中來源于一些特定的tRNAs類型[36]。在缺少輔助生殖技術(shù)的情況下，將精子sncRNAs用T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase，PNK)處理后，環(huán)磷酸鹽從RNA的3′-端脫落，從而可以復(fù)制這些RNA序列，使得tsRNAs的表達(dá)水平升高。這表明，在雄性生殖系統(tǒng)中，RNaseA和/或RNase T家族內(nèi)切酶參與tsRNAs的加工過程[37]。tsRNAs可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)[38]。tsRNAs在精子中的相關(guān)功能目前尚不清楚，推測不同類型的tsRNAs可能通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮作用。

rsRNAs是新近發(fā)現(xiàn)的一類在成熟精子中大量表達(dá)的sncRNAs，來源于rRNAs的5′-端部分。在RNA聚合酶Ⅰ(RNA polymeraseⅠ, PolⅠ)的作用下，由前體rRNAs(45S pre-rRNAs)轉(zhuǎn)錄而來，并最終生成一系列的rsRNAs，包括18S、5.8S、28S rsRNAs[39]。在哺乳動物中，rRNAs基因(rDNAs)由許多重復(fù)序列(nucleolar organizer regions, NORs)成簇組成，中間有間隔序列(long intergenic spacers, IGSs)，可通過改變轉(zhuǎn)錄頻率或是轉(zhuǎn)錄本基因拷貝數(shù)來調(diào)控rRNAs的生成，例如改變DNA甲基化水平、組蛋白修飾、核小體的位置等方式激活/沉默rRNAs的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而影響生物體的發(fā)育與分化[39]。目前研究表明，成熟精子中的rsRNAs主要來源于28S，稱之為rsRNA-28S，約為21～45 nt，其主要在小鼠附睪尾部成熟精子中大量表達(dá)[30, 40, 41]。此外，在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠精子中，rsRNA-28S大量表達(dá)，表明其高表達(dá)可能和炎癥反應(yīng)相關(guān)[40]。由于目前關(guān)于精子rsRNAs的研究才剛剛起步，其在精子細(xì)胞中的表達(dá)及功能還有待進(jìn)一步的探索。

miRNAs是目前研究較多的一類精子sncRNAs。其特征為具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，長度約為22 nt。miRNAs來源于幾百個(gè)帶有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的核苷酸轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNAs(primary miRNAs, pri-miRNAs)后，在RNase Ⅲ Drosha的作用下產(chǎn)生miRNAs前體(precursor miRNAs, pre-miRNAs)。pre-miRNAs含有1個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，長度約為70～100 nt，這些pre-miRNAs在輸出蛋白5(exportin 5)的幫助下出核進(jìn)入胞質(zhì)，在胞質(zhì)中由RNase Ⅲ Dicer切割形成成熟miRNAs。成熟miRNAs與Argonatue(Ago2)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，通過堿基互補(bǔ)配對定位于靶mRNA的3′-非編碼區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)，最終導(dǎo)致靶mRNA降解或是翻譯抑制，從而在表觀遺傳水平下調(diào)基因的表達(dá)[42-46]。值得注意的是，miRNA-mRNA是一個(gè)較為復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)miRNA可以靶向許多mRNAs；同時(shí)，1個(gè)mRNA也可以被許多miRNAs調(diào)控。

piRNAs也是精子細(xì)胞中時(shí)空特異性表達(dá)的一類sncRNAs。成熟的piRNAs由長的單鏈轉(zhuǎn)錄本切割產(chǎn)生，長度為24～32 nt，主要成簇分布在長度在20～90 kb的基因簇上。piRNAs的來源主要為：基因組中的piRNA簇或轉(zhuǎn)座子區(qū)域、內(nèi)含子及外顯子序列。piRNAs具有以下特性：可特異性地與PIWI家族蛋白質(zhì)成員相互作用，5′-末端具有很強(qiáng)的U堿基偏好性；3′-末端被2′-O-Me修飾，以保護(hù)其免受核酸外切酶降解[47]。在哺乳動物中，piRNAs生成途徑主要有2種：初級生成途徑和次級生成途徑[48]。目前認(rèn)為，PIWI/piRNA主要具有沉默抑制基因組遺傳元件，調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等作用[49, 50]。研究發(fā)現(xiàn)，在mili缺失突變的小鼠睪丸中，L1 elements的甲基化水平明顯下降，表明piRNAs可能參與介導(dǎo)了L1 elements的甲基化修飾[51]。piRNAs還能通過序列不完全互補(bǔ)配對識別靶mRNA，以一種類似miRNA的機(jī)制介導(dǎo)其翻譯抑制，在小鼠精子發(fā)育后期mRNA大規(guī)模清除[50]。此外，小鼠PIWI/piRNA還能通過與翻譯起始因子eIF3F相互作用，介導(dǎo)精子發(fā)育中huR結(jié)合的mRNA翻譯[49]等。目前僅在線蟲中發(fā)現(xiàn)了piRNAs介導(dǎo)的環(huán)境暴露相關(guān)跨代遺傳現(xiàn)象[52]，Rechavi等[53]發(fā)現(xiàn)，在饑餓情況下，線蟲piRNAs生成增加，營養(yǎng)相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，且變化可持續(xù)至F3代。Belicard 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，提高線蟲的培養(yǎng)溫度(從20 ℃提高至25 ℃)，piRNAs的生成將會減少，并可導(dǎo)致基因表達(dá)變化，該變化同樣可持續(xù)至F3代。在同樣的培養(yǎng)條件下，病菌感染則會使線蟲piRNAs生成的增加，子代的健康狀況也得到了一定程度的恢復(fù)。但哺乳動物中相關(guān)研究報(bào)道則較少。

2.2 精子sncRNAs介導(dǎo)的跨代遺傳

首次證明精子RNAs可以影響子代表型的研究是在小鼠模型中進(jìn)行的副突變相關(guān)研究。在該研究中發(fā)現(xiàn)，在Kit(酪氨酸激酶受體)轉(zhuǎn)基因的純合雄性小鼠所產(chǎn)生野生型后代中，具有和其父代一樣的表型(尾顏色發(fā)生變化，呈白色)。若將Kit突變小鼠純化的精子RNAs通過顯微注射進(jìn)野生型受精卵，可將父代白尾的突變表型傳遞給子代[55]。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，若分別將靶向Cdk9和Sox9的RNAs同樣顯微注射進(jìn)野生型受精卵中，這2個(gè)基因的表達(dá)水平會升高，并引起嚴(yán)重的表型變化(分別是心肌肥大和巨人癥)[56]。越來越多的研究證明，sncRNAs是精子中重要的表觀遺傳因子，它們可能參與調(diào)控跨代遺傳。

動物模型方面，目前研究較多的環(huán)境暴露是飲食暴露[57]。低蛋白質(zhì)或是高脂飲食小鼠的成熟精子中sncRNAs表達(dá)水平發(fā)生變化。雄鼠給予低蛋白質(zhì)飲食暴露后，其雄性子代可產(chǎn)生與父代類似的肝的膽固醇生物合成異常，精子中5′-tsRNAs(5′-端tRNA來源的tsRNAs)，例如tRF-GlyGCC、tRF-GlyTCC、 tRF-GlyCCC(均為解碼甘氨酸的tRNA來源的5′-tsRNAs，GCC、TCC、CCC為tRNA的反密碼子，下同)，tRNA-LysCTT以及tRNA-HisGTT的表達(dá)水平上調(diào)，miRNA(let-7c)表達(dá)下調(diào)[4]；Carone等[20]對父代低蛋白質(zhì)飲食暴露的小鼠子代的肝細(xì)胞進(jìn)行基因組測序，發(fā)現(xiàn)子代膽固醇及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，其表觀遺傳修飾發(fā)生改變，例如胞嘧啶甲基化修飾，多個(gè)miRNAs的表達(dá)水平(例如miR-210、let-7a、let-7f-1、let-7f-2、miR-21、miR-98、miR-199)也發(fā)生變化。另有研究表明，高脂飲食暴露將導(dǎo)致雄性小鼠精子tsRNAs表達(dá)水平整體升高。同時(shí)，將小鼠精子tsRNAs通過顯微注射進(jìn)野生型受精卵，子代將產(chǎn)生和父代類似的新陳代謝表型。這表明，tsRNAs可以作為父代飲食暴露相關(guān)的表觀遺傳信息傳遞者[1, 41]。在大鼠中，高脂飲食暴露同樣可改變精子中一些sncRNAs的表達(dá)，包括piRNAs(piR-025883, piR-015935, piR-036085)，miRNAs(let-7c, miR-293, miR-880)以及tRNA-GluCTC[58]。Cropley等對雄性小鼠進(jìn)行西方飲食(western diet)暴露，父代小鼠具有肥胖及糖尿病前期病癥表型，所產(chǎn)F1、F2代雄性小鼠即使給予健康飲食，其新陳代謝仍表現(xiàn)異常。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1子代小鼠精子中，多個(gè)sncRNAs表達(dá)發(fā)生變化，例如miR-10a、miR-10b表達(dá)顯著上調(diào)，tRNA-GlyGCC、tRNA-GluCTC表達(dá)水平明顯降低[11, 59]。若將這些雄性小鼠精子或是睪丸中RNAs顯微注射進(jìn)正常受精卵中，則所產(chǎn)子代可重現(xiàn)這些表型。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，若在野生型受精卵中注射單一的miRNA(miR-19)即可在子代中實(shí)現(xiàn)表型重現(xiàn)；該子代和正常雌鼠交配后，部分代謝異常表型在其后代(subsequent generations)中仍會出現(xiàn)[11]。以上研究均表明，精子sncRNAs參與了環(huán)境暴露導(dǎo)致跨代遺傳，尤其是tsRNAs與let-7較易受飲食影響而發(fā)生表達(dá)變化。

心理壓力同樣會導(dǎo)致精子sncRNAs表達(dá)水平變化，例如早期生活創(chuàng)傷或是慢性壓力等。由于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病與下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)相關(guān)，例如精神分裂癥和抑郁癥等[60]。因此，心理壓力也可能對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。有研究表明，父代遭受長期壓力應(yīng)激后，小鼠精子中9個(gè)miRNAs表達(dá)發(fā)生顯著變化，同時(shí)子代HPA軸應(yīng)答遲緩[12]。研究進(jìn)一步將這9個(gè)miRNAs混合后，顯微注射到正常受精卵中，所產(chǎn)子代同樣表現(xiàn)為HPA軸失調(diào)[13]。另一項(xiàng)研究表明，通過給交配前的雄性小鼠(F0代)持續(xù)4周服用含有糖皮質(zhì)激素(corticosterone, CORT)的水來模擬應(yīng)激狀態(tài)下父代小鼠的生理變化，盡管糖皮質(zhì)激素并不產(chǎn)生父代小鼠的焦慮行為，但其F1雄性小鼠具有類似的焦慮行為，F(xiàn)1雌性小鼠則表現(xiàn)為恐懼消失。有趣的是，父本印記基因Igf2的表達(dá)在F1雄性后代參與應(yīng)激的大腦海馬中表達(dá)增加，但在雌性后代海馬中則表達(dá)下調(diào)。糖皮質(zhì)激素組F2代雄性和雌性小鼠均表現(xiàn)為焦慮程度降低，但只有糖皮質(zhì)激素組F2雄性小鼠抑郁行為增加；與對照組相比，糖皮質(zhì)激素組后代精子中，大量sncRNAs表達(dá)發(fā)生變化，其中主要為miRNAs。其中，3種miRNAs(miR-98、miR-144和miR-190b)表達(dá)水平升高，預(yù)測它們可能與多種生長因子(包括Igf2和Bdnf)相關(guān)[61]。在創(chuàng)傷性壓力小鼠模型中，雄性小鼠暴露于母子分離所帶來的早期生活壓力(maternal separation coupled with unpredictable maternal stress, MSUS)，此類壓力現(xiàn)象可傳遞給子代(F1、F2代)，使其行為學(xué)以及新陳代謝發(fā)生異常，且F1代小鼠精子中miRNAs表達(dá)水平上調(diào)，piRNAs表達(dá)下調(diào)。值得注意的是，在F2、F3代中，雖然具有類似的表型，但精子sncRNAs表達(dá)水平則未見明顯變化。若將父代小鼠精子sncRNAs顯微注射進(jìn)正常受精卵中，所產(chǎn)子代與父代的表型類似[6]。此外，進(jìn)一步的研究顯示，父代早期生活創(chuàng)傷可影響精子sncRNAs以及長非編碼RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)，通過顯微注射的方式，分別將sncRNAs與lncRNAs注射進(jìn)正常受精卵，產(chǎn)生的子代具有不同的表型，sncRNAs組表現(xiàn)為體重異常，抑郁傾向；lncRNAs組表現(xiàn)為新陳代謝異常，較為焦慮[62]。以上研究表明，壓力和應(yīng)激水平的變化可以改變精子sncRNAs表達(dá)水平，并且這些變化可能影響后代的表型。

毒性物質(zhì)暴露也可產(chǎn)生跨代遺傳。例如，雌性大鼠孕前vinclozolin(乙烯菌核利，一種農(nóng)藥)暴露可導(dǎo)致子代大鼠生精細(xì)胞凋亡，腎組織異常等，其F3代雄性大鼠具有類似表型，且精子中大量sncRNAs表達(dá)發(fā)生變化，其中變化最多的是tsRNAs中的5′-halves[63]。若對雌性小鼠孕前進(jìn)行DDT(殺蟲劑)暴露，其表型(例如肥胖)可在子代雄鼠中重現(xiàn)，并可傳遞至F3代。其中，每一代小鼠精子的DNA甲基化水平、sncRNAs表達(dá)水平均發(fā)生顯著變化[64]。若父代雄鼠長期酒精暴露，可增加子代雄鼠的酒精耐受以及子代雌鼠的焦慮情緒；同時(shí)，通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，子代精子中tsRNAs、線粒體小RNA以及miRNAs的表達(dá)水平發(fā)生變化；精子sncRNAs的轉(zhuǎn)錄后修飾受到影響，線粒體tRNAs中2種核苷修飾增加，附睪中tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSun2表達(dá)水平降低[65-67]。由于NSun2是一種5′胞嘧啶甲基的生成酶[68]，因此推測酒精暴露可能影響tsRNAs的表達(dá)。

另有其他一些暴露同樣可導(dǎo)致跨代遺傳。例如有研究發(fā)現(xiàn)，雄鼠感染弓形蟲后，精子的密度和活動力等均有顯著降低，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示大腦受損，神經(jīng)精神行為異常，精子sncRNAs表達(dá)水平也發(fā)生顯著變化，其F1、F2子代同樣具有類似表型；同時(shí)，若將父代雄鼠精子sncRNAs通過顯微注射進(jìn)野生型受精卵，所產(chǎn)子代也具有部分類似表型[69]。另有一些暴露對機(jī)體有良性促進(jìn)作用。例如，體育鍛煉與認(rèn)知訓(xùn)練可增加小鼠大腦突觸可塑性，并且該現(xiàn)象會傳遞給子代；進(jìn)一步通過顯微注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象可能是通過精子sncRNAs介導(dǎo)的，尤其是miRs-212/132在其中發(fā)揮了重要作用[70]。

綜上所述，許多研究證實(shí)，環(huán)境暴露可影響精子sncRNAs的表達(dá)(Table 1)。例如，飲食暴露主要影響tsRNAs與let-7表達(dá)，壓力主要影響miRNAs表達(dá)等。此外，值得注意的是，由于環(huán)境暴露種類和暴露時(shí)間的不同，可能會導(dǎo)致不同的表觀遺傳因子在其中發(fā)揮主要作用。例如，小鼠從出生到斷奶期間進(jìn)行低蛋白質(zhì)飲食暴露，精子中rDNAs(ribosomal DNAs)的DNA甲基化水平發(fā)生變化[71]；然而，若小鼠從斷奶開始低蛋白質(zhì)飲食暴露，其中sncRNAs的表達(dá)水平發(fā)生變化，但是rDNAs的甲基化水平則未見發(fā)生明顯變化[4, 72]。其中具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

2.3 環(huán)境因素影響精子sncRNAs的可能機(jī)制

父代環(huán)境因素是如何影響配子表觀遺傳信息以及子代表型的？如上所述，許多研究證實(shí)，父代環(huán)境因素可影響精子sncRNAs水平；然而，研究人員對于環(huán)境暴露是如何影響精子sncRNAs表達(dá)的仍知之甚少。已有研究顯示，父代環(huán)境因素可能通過以下途徑影響精子sncRNAs表達(dá)。

環(huán)境暴露可能直接影響sncRNAs表達(dá)。臨床研究表明，在創(chuàng)傷后的壓力失調(diào)及抑郁癥傾向人群中，其血液中的Dicer1表達(dá)水平降低，而壓力刺激相關(guān)的大腦杏仁體活性升高[73]。Dicer1是RNase III 核酸內(nèi)切酶，參與經(jīng)典miRNAs生成途徑[74]。它在精子發(fā)生和維持男性生育力中發(fā)揮作用，在雄性小鼠原始生殖細(xì)胞(primary germ cells, PGCs)中條件性敲除Dicer1，可導(dǎo)致雄性子代PGCs生成異常，精子發(fā)育阻滯在圓形精子階段[75, 76]。Dias等[77]發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦伏核區(qū)的Dicer1可能參與下游β-catenin/Wnt信號通路，在長期恐懼壓力下的小鼠中，若將Dicer1敲除，壓力相關(guān)表型隨之消失。有研究表明，長期壓力下，小鼠神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，并可通過影響Dicer1的活性，抑制miRNAs的生成，導(dǎo)致miRNAs的表達(dá)水平降低[78]；而同時(shí)有研究表明，原發(fā)性不育癥患者體內(nèi)，其氧化應(yīng)激水平通常較高[79]。在精子中，Dicer1是否也發(fā)揮類似功能，有待更多的研究。

精子sncRNAs也可通過膜泡(extracellular vesicles, EVs)或類似結(jié)構(gòu)進(jìn)入精子。最近研究發(fā)現(xiàn)，附睪小體(epididymosomes, EPs)中有miRNAs與tsRNAs表達(dá)，這些sncRNAs可以通過附睪小體與精子的相互作用，從而遷移到精子中。說明附睪可以作為環(huán)境感知器官，將這些信息通過膜泡以sncRNAs的形式傳遞給成熟精子，從而影響子代的表型[15, 80-83]。父代酒精暴露小鼠模型中，附睪小體中tsRNAs變化與精子中的變化類似，提示精子中sncRNAs可能來源于附睪小體[65]。有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖及精神壓力可引起炎癥[84, 85]，在高脂飲食暴露導(dǎo)致的肥胖[86]，或心理應(yīng)激情況[87]下，小鼠血睪屏障破壞，體細(xì)胞膜泡加速遷移至發(fā)育的生精細(xì)胞與精子細(xì)胞。在上文中提到的酒精暴露小鼠中，附睪中NSun2表達(dá)水平的降低，可導(dǎo)致附睪小體中tsRNAs水平升高[65]。研究進(jìn)一步將正常小鼠精子與酒精暴露組的精子附睪小體共孵育，并通過IVF(invitrofertilization)產(chǎn)生子代，發(fā)現(xiàn)子代同樣具有父代焦慮表型，并對酒精的敏感度降低。該研究表明，附睪中的附睪小體可將酒精暴露引起的表型傳遞給子代[66]。此外，精液樣本中含有大量微生物[88]，可以釋放與附睪小體類似的膜泡，并有可能給改變精子中sncRNAs表達(dá)水平[89]。因此，含有sncRNAs的膜泡作為遷移載體，可介導(dǎo)精子-精子和/或雌性-精子信息交流。類似的研究有望建立新的環(huán)境因素相關(guān)的進(jìn)化機(jī)制。

Table 1 Selection of studies providing evidence of transgenerational inheritance of sperm sncRNAs in murine models

環(huán)境暴露還可能影響精子sncRNAs的遷移。游離于膜泡外的體液中的sncRNAs可通過結(jié)合蛋白質(zhì)，具有特殊的二級結(jié)構(gòu)，或是特定的RNA修飾，從而穩(wěn)定存在[90, 91]，并在細(xì)胞間進(jìn)行遷移。有研究發(fā)現(xiàn)，特定的5′-tsRNAs可具有G-4偶聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而參與神經(jīng)保護(hù)應(yīng)答。有趣的是，含有G-4偶聯(lián)體結(jié)構(gòu)的tsRNAs會被神經(jīng)元細(xì)胞吸收[92]。這表明，該特殊結(jié)構(gòu)可促進(jìn)sncRNAs的跨膜運(yùn)動。該現(xiàn)象意味著，雖然大多數(shù)血清中的tsRNAs都是以游離形式存在于膜泡外，但它們或可通過特定的結(jié)構(gòu)(例如G-4偶聯(lián)體)，從而進(jìn)入精子細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)sncRNAs的遷移，為sncRNAs表達(dá)變化提供了新的研究方向。

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑也會影響sncRNAs的表達(dá)。成熟的精子中包含許多mRNAs與sncRNAs[93]。最近，通過過表達(dá)賴氨酸特異的組蛋白脫甲基酶1(lysine-specific histone demethylase 1，LSD1)轉(zhuǎn)基因小鼠，可以觀察到，父代LSD1過表達(dá)會影響子代的發(fā)育，而后代生殖細(xì)胞系中該基因的表達(dá)缺失，但缺陷表型仍然存在[94]。這些轉(zhuǎn)基因?qū)е碌娜毕莶⒉荒芡ㄟ^CpG島DNA甲基化水平變化而傳遞，而是與子代正常精子中的異常RNAs表達(dá)水平相關(guān)。推測精子RNAs表達(dá)異常可能導(dǎo)致子代表型缺陷。這有可能是由于異常表達(dá)的精子RNAs導(dǎo)致的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，并反過來影響RNAs表達(dá)。目前，在線蟲中已發(fā)現(xiàn)類似的RNA依賴的反饋調(diào)控機(jī)制[52, 95]，而在哺乳動物中這一觀點(diǎn)有待進(jìn)一步證實(shí)。

3 問題與展望

越來越多的證據(jù)表明，在哺乳動物中，父代環(huán)境因素產(chǎn)生的影響可以通過精子傳遞給子代，sncRNAs則可能作為精子中環(huán)境因素相關(guān)的表觀遺傳因子，參與父源性的跨代遺傳。目前，環(huán)境暴露相關(guān)動物研究主要集中在飲食暴露和壓力應(yīng)激等，對人類活動中較為常見酒精暴露和尼古丁暴露等則涉及較少。同時(shí)，關(guān)于精子sncRNAs在跨代遺傳中的作用，仍有許多重要的科學(xué)問題待解決。例如，一種環(huán)境暴露是否影響某一類特定的表觀遺傳因子；不同的表觀遺傳因子之間是否存在相互作用；環(huán)境因素是通過何種方式影響精子中sncRNAs表達(dá)變化的？精子中sncRNAs表達(dá)水平的變化是如何影響受精卵，乃至子代健康的？隨著單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，可以對精子與胚胎的sncRNAs進(jìn)行更為詳細(xì)的鑒定分析，所涉及的相關(guān)機(jī)制也將得到深入探索，從而為研究跨代遺傳的獲得性表型提供思路，并通過結(jié)合人群流行病調(diào)查結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)，為人類生殖健康相關(guān)研究提供新的線索，為相關(guān)疾病(例如糖尿病)的診斷、靶向治療及預(yù)后評估等提供分子靶點(diǎn)。