李可欣， 田同同， 周 波,2)*

(1)東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 哈爾濱 150040；2)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))， 哈爾濱 150040)

植物中的 miRNA(microRNA)由MIR基因編碼，其生物化學(xué)合成途徑包括3個主要步驟：轉(zhuǎn)錄、加工和功能復(fù)合物裝配。高通量測序等生物技術(shù)的進步和發(fā)展使鑒定大量編碼基因和非編碼RNA成為可能。成熟的miRNA長度大多為21 nt，它們與Argonaute (AGO)家族蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)后進一步通過降解靶mRNA或抑制翻譯來負(fù)調(diào)控基因表達水平[1-2]。

植物miRNA結(jié)合和調(diào)控靶基因表達的方式主要有3種類型：翻譯抑制、剪切降解和介導(dǎo)植物DNA的甲基化。通常認(rèn)為翻譯抑制和剪切降解取決于miRNA與靶RNA之間互補配對的復(fù)雜性。序列幾乎或完全互補時會引起靶mRNA的快速降解；當(dāng)序列互補程度較低時，靶mRNA的翻譯被直接抑制，有效達到蛋白質(zhì)表達量降低的效果。此外，植物中的MIR基因還可以通過轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)目標(biāo)DNA甲基化的水平[3]。

植物在生長發(fā)育的過程中受到外部環(huán)境的影響，本文主要概述了參與非生物脅迫和植物次生代謝功能相關(guān)的miRNA及其靶基因的研究進展，以期更好的理解參與次生代謝和環(huán)境響應(yīng)的miRNA的調(diào)控通路和功能。

1 植物微RNA與次生代謝

1.1 黃酮類生物合成相關(guān)miRNA

黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛分布于高等植物中的一類次生代謝產(chǎn)物，具有增強免疫力、預(yù)防及治療心血管疾病、抑癌[4-5]、抗衰老和抗病毒等生理活性。研究證明，miRNAs主要通過調(diào)控參與黃酮類化合物合成過程的關(guān)鍵基因或轉(zhuǎn)錄因子，影響植物的多種生理進程[6]。近年來，花青素(anthocyanins)的合成調(diào)控得到了廣泛研究，明確了MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、SPL(squamosa promoter-binding protein like)等轉(zhuǎn)錄因子家族作為miRNA的靶標(biāo)廣泛參與花青素的合成。Li等[7]通過小RNA測序、KEGG通路分析等技術(shù)將miR858確定為奇異果花青素合成的負(fù)調(diào)控因子，miR858的過度表達導(dǎo)致其靶基因MYBC1編碼的MYBC1轉(zhuǎn)錄因子表達量下降，不能啟動與花青素合成關(guān)鍵酶無色花青素雙加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，LODX)基因的表達，進而使得花青素的積累量下調(diào)。對茶樹miR828a的研究表明，其能夠靶向MYB4、MYB23和MYB82，進而負(fù)調(diào)節(jié)花青素的合成水平[8]。在過表達miR156的蘋果[9]和白楊[10]中，也發(fā)現(xiàn)了多種轉(zhuǎn)錄因子MYB、SPL表達量下調(diào)，花青素水平變化的現(xiàn)象。因此，miRNA作為非編碼的sRNA可以通過靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，調(diào)控植物花青素合成途徑，這為理解植物花青素合成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了更多的線索。

1.2 萜類生物合成相關(guān)miRNA

青蒿素(artemisinin，ART)作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其生物合成過程得到了廣泛的研究。Khan等人[11]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿的miR159、miR172和miR166均靶向細(xì)胞色素P450還原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)合成基因。CPR參與催化青蒿素合成的三個步驟。miR858的靶基因是編碼紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase, ADS)的ADS。ADS也是參與青蒿素合成過程中的關(guān)鍵酶，在青蒿素合成通路中發(fā)揮著重要作用。極少種miRNA能夠增強青蒿素的表達，如miR5083和miR403可正調(diào)控NAC1基因，上調(diào)ADS、細(xì)胞色素P450單加氧酶基因CYP71AV1的表達量。Saifi等人[12]發(fā)現(xiàn)，miRStv_11和miR319 g分別上調(diào)貝殼杉烯酸羥化酶(Kaurenoicacid-13-hydroxylase，KAH)和下調(diào)貝殼杉烯氧化酶 (Kaureneoxidase，KO)、貝殼杉烯合酶 (Kaurenesynthase，KS)的表達。KAH、KO、KS都是參與合成甜菊苷的重要酶類。

1.3 生物堿類生物合成相關(guān)miRNA

生物堿(alkaloid)是一類含氮小分子化學(xué)物質(zhì)，種類繁多，合成途徑復(fù)雜。pso-miR13和pso-miR 2161能分別抑制BIA生物合成過程中的關(guān)鍵酶7′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶 (7′-O- transmethylase,7-OMT)和4′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(4′-O- transmethylase,4-OMT)基因，從而下調(diào)芐基異喹啉生物堿(benzylisoquinoline alkaloid，BIA)表達[13]。在馬鈴薯中鑒定發(fā)現(xiàn)，miR408靶向VS1環(huán)化酶(vetispiradiene cyclase)的合成基因，VS1的作用底物是糖苷生物堿合成過程的前體物質(zhì)法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)。miR408抑制VS1的合成導(dǎo)致底物FPP含量增加，從而使糖苷生物堿獲得一定的積累。Chen等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，在火龍果中多種miRNA通過下調(diào)甜菜堿合成通路中目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平參與甜菜堿的積累過程。例如miR157b靶向SPL6、miR858靶向MYBC1和MYB12等。

Fig.1 The miRNA-mediated synthesis pathway of secondary metabolites in plants A variety of miRNAs affect the synthesis of secondary metabolites by promoting or inhibiting the expression of target genes in different plants. “—| ”means negative regulation. “→”means positive regulation

2 植物微RNA與非生物脅迫

2.1 植物miRNA與干旱脅迫

水是制約植物生存、發(fā)育和繁衍等各種生命活動不可或缺的重要因素。植物缺水時會導(dǎo)致體內(nèi)水分平衡被破壞，出現(xiàn)光合速率減弱、呼吸作用異常、葉片萎蔫等常見的生理生化變化，嚴(yán)重時造成植物死亡。人們在研究后發(fā)現(xiàn)，miRNA在維持植物水分平衡、抵抗干旱帶來的氧化應(yīng)激影響中發(fā)揮著不可忽視的作用。研究證明，大部分植物在干旱條件下都有與正常生理環(huán)境差異表達的miRNA，它們極有可能在消除氧化應(yīng)激影響中扮演著重要角色。有研究發(fā)現(xiàn)，大麥miR397的靶基因是漆酶基因LAC。漆酶能夠催化合成木質(zhì)素，被認(rèn)為參與了植物的發(fā)育和逆境反應(yīng)[16]。除此之外，Lpez-Galiano等人[17]的研究指出，miR159及其靶基因MYB33的表達模式相反。干旱脅迫模式下導(dǎo)致miR159下調(diào)和MYB33表達增強。miR166f是桑樹抵抗干旱的正調(diào)控因子。過表達miR166f會使靶標(biāo)同源異型域—亮氨酸拉鏈(HD-Zip)轉(zhuǎn)錄因子和具有組蛋白精氨酸去甲基化酶活性的JMJD6(Jmjc domain-containing 6，JMJD6)表達量下調(diào)，這種變化增強了桑樹對干旱環(huán)境的適應(yīng)性[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在水分充足和干旱情況下西藏沙棘(Hippophaethibetana)2種新miRNA(novel_miR_24和novel_miR_87)的表達量發(fā)生了顯著變化[19]。這在一定程度上為完善miRNA參與的耐旱植物復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。研究表明，低到中等程度表達miR156可以沉默花青素合成關(guān)鍵酶二氫黃酮醇-4-還原酶((dihydroflavonol 4-reductase,DFR)編碼基因的轉(zhuǎn)錄阻遏因子SPL13，增強紫花苜蓿的抗旱能力。

2.2 植物miRNA與溫度脅迫

2.2.1 植物miRNA與高溫脅迫 高溫脅迫能夠造成植物生物膜破壞，葉片出現(xiàn)死斑和萎蔫，光合速率和蒸騰速率下降，呼吸速率降低等多種不利影響。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中miR160可以對ARF17，ARF16和ARF10等靶基因的表達產(chǎn)生抑制作用，對增強熱脅迫的適應(yīng)力產(chǎn)生消極影響[21]。在玉米中也發(fā)現(xiàn)了幾個關(guān)鍵的熱響應(yīng)miRNA及其對應(yīng)的靶標(biāo)。高溫下miR172、miR164、miR396被抑制表達，導(dǎo)致靶向的AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)、NAC和生長調(diào)控因子(growth-regulating factor，GRF)下調(diào)，器官發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程均被影響[22]。為闡明miRNA介導(dǎo)的玉米對高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供了研究基礎(chǔ)。Ahmed等人[23]對38℃熱處理后的大白菜葉片組織RNA文庫進行測序，得出miR172在高溫脅迫下調(diào)控開花白菜中包括花期同源蛋白質(zhì)AP2、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的AP2-like轉(zhuǎn)錄因子表達的結(jié)論。棉花在產(chǎn)孢子的細(xì)胞增殖階段、減數(shù)分裂階段、小孢子釋放階段和花粉成熟階段分別由多種miRNA及其靶基因響應(yīng)干旱脅迫[24]。例如miR172與其靶基因AP2在減數(shù)分裂時期發(fā)揮防御作用，花粉成熟的最后階段則由miR393-TIR1/AFB(transport inhibitor response 1/Auxin signaling F-box)積極響應(yīng)。這些miRNA是棉花適應(yīng)高溫環(huán)境的主要和重要調(diào)控因子，具有正向或負(fù)向調(diào)控模式。

2.2.2 植物miRNA與低溫脅迫 溫度是影響植物生長發(fā)育和果實采后生活質(zhì)量的主要環(huán)境因子。為了研究miR528提高水稻抗寒性的潛在分子作用機制，Tang等人[25]檢測了脅迫相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子在miR528轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞中的表達量。研究證明，miR528通過抑制脅迫應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYB30基因的表達，從而增強BMY2、BMY6和BMY10基因表達量增加，進而增強細(xì)胞活性、活化抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)等提高水稻對低溫的耐受性。在香蕉中也發(fā)現(xiàn)，許多參與響應(yīng)低溫脅迫的miRNA及靶標(biāo)例如SPL、蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)等[26,27]。它們參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，協(xié)調(diào)調(diào)控冷脅迫下機體的許多生化反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，部分藥用植物黃芪響應(yīng)冷脅迫的部分基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中miR168通過靶向AGO基因在反饋調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miR858、miR171、miR169等多個miRNA通過靶向多種轉(zhuǎn)錄因子例如SPL、MYB調(diào)控植物生長發(fā)育過程[28]。

2.3 植物miRNA與鹽脅迫

鹽分對植物的生長有著至關(guān)重要的作用，但超過一定限度，過量的可溶性鹽對植物將產(chǎn)生毒害作用。過高的鹽分容易引發(fā)次生脅迫，例如氧化應(yīng)激反應(yīng)和營養(yǎng)代謝失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、生長抑制和作物產(chǎn)量下降等諸多問題的發(fā)生。鐵超氧化物歧化酶(iron superoxide dismutase 1 ，F(xiàn)SD1)是棉花抵抗鹽脅迫的重要酶。過表達miR414c的棉花FSD1表達量下降，使棉花抵御鹽毒害的能力顯著下降[29]。miR408在植物中穩(wěn)定存在，核酸序列保守，過表達大麥miR408的煙草株系在磷饑餓和鹽脅迫條件下有明顯的表型變化，且miR408的靶基因磷酸轉(zhuǎn)運體(phosphate transporter，PT)基因NtPT2、編碼脫落酸受體和SnRK2蛋白質(zhì)的基因NtPYL2和NtSAPK3轉(zhuǎn)錄豐度較野生型相比均有所上調(diào)，增強了大麥吸收磷的能力[30]。Ma等人[31]則通過研究驗證了miR156a靶向SPL13轉(zhuǎn)錄因子，SPL13進一步靶向參與多種植物鹽脅迫耐受生物通路的轉(zhuǎn)錄因子WRKY100的啟動子區(qū)域，闡明了蘋果miRNA響應(yīng)鹽脅迫的網(wǎng)絡(luò)機制。另有研究分析了鹽生植物紅砂miRNA參與鹽脅迫環(huán)境下種子萌發(fā)的具體機制。研究數(shù)據(jù)顯示，miR4995和miR396分別靶向編碼脫落酸8’-羥化酶的關(guān)鍵基因CYP707A2和生長素通路中的重要基因HB33，參與紅砂種子的萌發(fā)[32]。

2.4 植物miRNA與重金屬脅迫

鐵、銅、鋅等重金屬在植物體內(nèi)多種生理過程中發(fā)揮重要作用。然而重金屬在植物體內(nèi)的過度積累會毒害植物，影響植物的生長和生產(chǎn)力。此外，重金屬的積累還會影響植物的生長和生產(chǎn)力，通過食物鏈富集對人和動物產(chǎn)生影響，引發(fā)疾病，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。銅元素是多種酶的輔因子，也是質(zhì)體藍(lán)素的重要組成部分。銅積累會制約植物的光合作用和新陳代謝等過程，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞、活性氧基團增加。研究發(fā)現(xiàn)，miR393及靶標(biāo)運輸抑制劑響應(yīng)蛋白1 (transport inhibitor response 1,TIR1)、AFB1、AFB2和AFB3的相互作用，可能在葡萄維持銅離子穩(wěn)態(tài)中扮演著重要角色[33]。在山核桃中也發(fā)現(xiàn)，能夠靶向銅鋅超氧化物歧化酶和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶5b亞基的miR398[34]。抑制miR398的表達可以使超氧化物歧化酶濃度增加，清除氧自由基，減輕銅的毒害影響。鎘元素也會對植物產(chǎn)生氧化毒害作用，鎘的積累會導(dǎo)致植物發(fā)育不良，植株枯黃甚至死亡。Jian等人[35]研究認(rèn)為，玉米中miR166靶向bZIP轉(zhuǎn)錄因子(basic region-leucine zipper，bZIP)、miR156b靶向Squamosa啟動子結(jié)合蛋白(squamosa promoter binding protein,SBP)，并且可能是通過負(fù)調(diào)控來維系玉米根系中Cd2+的穩(wěn)態(tài)。在鎘處理后的水稻中也發(fā)現(xiàn)，miR268的靶基因自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白3表達顯著下降的現(xiàn)象[36]。

Fig.2 The miRNA-mediated pathway under abiotic stress Various miRAs are involved in response to abiotic stress by targeting different transcription factors in plants. These transcription factors play a positive or negative role in enhancing plant stress tolerance. “—| ”means negative regulation. “→”means positive regulation

3 次生代謝與非生物脅迫的聯(lián)系

當(dāng)植物受到外環(huán)境不利因素影響時，miRNA及次生代謝產(chǎn)物會發(fā)生相應(yīng)變化以響應(yīng)壓力刺激，減輕活性氧基團對機體的毒害作用。

木質(zhì)素、花青素等多種次生代謝產(chǎn)物被認(rèn)為在植物應(yīng)對生長和發(fā)育過程中對生物和非生物脅迫具有重要作用[37]。亞麻中次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素的形成與miR397b、miR397及各自的靶基因表達相關(guān)。miR319靶向轉(zhuǎn)錄因子MYB，預(yù)測其調(diào)控植物木質(zhì)素生物合成過程[38]。也有研究發(fā)現(xiàn)，甘薯參與花青素合成代謝的miRNA例如miR156、miR159大多數(shù)靶向參與響應(yīng)非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子例如MYB、SPL等，推測這些miRNA通過調(diào)控靶基因的表達量參與甘薯花青素的合成代謝，從而響應(yīng)逆境脅迫[39]。在應(yīng)激條件下，miR156-SPL9可能通過花青素著色產(chǎn)物因子PAP1(productionofanthocyaninpigment1 )和DFR途徑直接影響花青素的生物合成，進而阻斷花青素的生物合成，提高了植物對鹽脅迫和干旱脅迫的敏感性[40]。HY5(elongated hypocotyl 5)轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)花青素生物合成途徑中參與低溫響應(yīng)的關(guān)鍵成分查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶的積累。低溫誘導(dǎo)下甜瓜miR319c表達量下降，從而促進HY5的增加[41]。

此外，某些非生物脅迫也會調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的合成與降解。鹽和干旱脅迫均可增強丹參miR396b的表達。過表達mR396b抑制丹酚酸的合成，促進了丹參酮的積累[42]。植物激素例如脫落酸、乙烯等也能通過調(diào)控信號傳導(dǎo)過程參與植物響應(yīng)逆境的生理過程。Sun等人[43]在鹽脅迫處理的蘿卜轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)miR160b表達上調(diào)，其靶基因ARF16和ARF17在調(diào)節(jié)生長素表達過程中發(fā)揮作用。在甘薯、黃芪[44]和浮萍[45]中，也發(fā)現(xiàn)類似的miRNA靶向ARF，響應(yīng)非生物脅迫的現(xiàn)象。這在一定程度上說明，miR160及其靶基因生長素響應(yīng)因子ARF在響應(yīng)非生物脅迫、調(diào)節(jié)生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。綜上所述，植物次生代謝與非生物脅迫具有密切聯(lián)系。環(huán)境壓力例如鹽、溫度會影響植物的代謝過程，調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的表達。次生代謝產(chǎn)物合成后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原等機制緩解或清除活性氧基團等的毒害作用，提高機體的生存率。

4 問題與展望

miRNA作為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)控因子，在協(xié)調(diào)次生代謝產(chǎn)物的生物合成和抵御環(huán)境壓力的過程中扮演了重要角色。保守miRNA例如miR160在多種植物，例如甘薯、黃芪和蘿卜中都靶向相似的基因家族，在非生物脅迫下發(fā)揮類似的作用[39,43,44]。非保守miRNA在不同植物中選擇性表達，調(diào)控不同生理過程。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及多領(lǐng)域交叉新興學(xué)科的誕生，多種參與次生代謝產(chǎn)物合成的植物miRNA及其靶基因被鑒定和預(yù)測出來，為完善miRNA調(diào)控次生代謝網(wǎng)絡(luò)，研究miRNA具體作用的分子機制提供了新方法和新思路。近年來，在不同種類的植物中也發(fā)現(xiàn)了大量參與響應(yīng)非生物脅迫的miRNA。這些miRNA與目標(biāo)基因的相互作用構(gòu)成監(jiān)管機體穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)的一個重要組成部分，控制各種生化反應(yīng)以響應(yīng)壓力，增強自身適應(yīng)環(huán)境的能力。目前，關(guān)于miRNA在參與合成次生代謝產(chǎn)物，以及次生代謝產(chǎn)物與非生物脅迫的聯(lián)系方面的研究性文獻較少，可供參考的數(shù)據(jù)不多，仍有較多植物尚未得到更深層次的探索。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與響應(yīng)環(huán)境壓力和調(diào)控次生代謝過程有關(guān)的miRNA，但對于miRNA在不同植物中調(diào)控非生物脅迫和次生代謝產(chǎn)物生物合成的具體機制尚未得到全面的研究，且大多集中在藥用植物和農(nóng)作物中。次生代謝產(chǎn)物在植物清除氧自由基，緩解惡劣環(huán)境毒害作用的分子機制也未見統(tǒng)一的結(jié)論，需要更多可靠的證據(jù)來證明它們的真正作用。研究者們較熱衷于挖掘與植物抵御惡劣環(huán)境的優(yōu)良特性相關(guān)miRNA及其作用基因，以期改良植物特性，培育優(yōu)勢作物，增加作物產(chǎn)量。由于miRNA發(fā)現(xiàn)較晚，在植物代謝、脅迫響應(yīng)通路中的研究較少，要想深入闡釋其分子機制，還有待于我們進一步探索和發(fā)現(xiàn)。相信在生物技術(shù)更加先進的未來，植物miRNA的作用機制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)能得到進一步的解讀和完善，為培育優(yōu)良品種做出貢獻。