孫俊永，張利軍，司瑞茹，劉 嫻，余 聰，甘 甜*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，福建 福州 350003； 2. 信陽師范學院 化學化工學院，河南 信陽 464000)

0 引言

磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶等磺胺類抗生素除了用于人類疾病的預防和治療，也常用于農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)，它們可通過食物鏈蓄積在人體中，對血液系統(tǒng)或者免疫系統(tǒng)造成損壞[1]，甚至會引起各種組織器官病變[2]。因此，開發(fā)一種簡單可靠的方法來檢測環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶十分必要。

目前已報道的磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的檢測方法主要包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-4]、高效液相色譜[5]及紫外分光光度法[6]等。這些檢測方法往往步驟復雜、耗時且難以實現(xiàn)實時在線監(jiān)測。電化學傳感器具有儀器設備簡單、響應速度快、靈敏度高、成本低和易實現(xiàn)微型化自動化等優(yōu)點，因而受到廣泛關注。對于電化學傳感器而言，構(gòu)建新型識別元件以滿足電化學傳感器敏感元件的要求具有重要的研究意義。

分子印跡聚合物(MIPs)是一類內(nèi)部具有固定形狀和大小的孔穴并具有確定排列功能基團的交聯(lián)高聚物，能夠選擇地識別模板分子或類似物，具有模擬天然受體的分子識別能力[7]。與生物敏感材料相比，MIPs有顯著的耐高溫、高壓、酸、堿性，可以應用于有金屬離子存在的環(huán)境以及有機溶劑中，可多次重復使用且易于保存，越來越成為一類重要的傳感器識別元件[8]。ZHANG等[9]以3,4-乙烯二氧噻吩和甲基丙烯酸為功能單體，通過電聚合方法在電極表面制備了測定磺胺二甲嘧啶的分子印跡電化學傳感器。WEI等[10]以吡咯為功能單體，在NiCo2O4納米針和石墨烯修飾電極上制備了分子印跡電化學傳感器用于食品中磺胺二甲嘧啶的分析。DA SILVA等[11]使用循環(huán)伏安法在玻碳電極表面制備了可特異性識別尿液中甲氧芐啶的聚吡咯膜，構(gòu)建過程簡單可控。韋貽春等[12]通過熱聚合將N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺功能單體、Pd納米粒子摻雜劑、馬來松香丙烯酸乙二醇酯交聯(lián)劑與甲氧芐啶模板分子進行聚合，洗去模板分子后制得了可識別和檢測甲氧芐啶的電化學傳感器，具有較好的選擇性。然而，使用分子印跡電化學傳感器對磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶進行同時檢測的研究尚未見報道。

本文以磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶為雙模板分子，利用溶膠-凝膠法制備了具有高識別性能的MIP，并基于此構(gòu)建了分子印跡電化學傳感平臺。采用循環(huán)伏安法(CV)和電化學交流阻抗譜(EIS)對電極修飾過程進行了表征，用微分脈沖伏安法(DPV)研究了磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的電化學行為，并對MIP制備和電化學測量參數(shù)進行優(yōu)化，旨在實現(xiàn)該傳感器對磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的高靈敏同時測定。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

異丙醇、鈦酸四丁酯(TBOT)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、四氯化鈦(TiCl4)、磺胺二甲嘧啶、甲氧芐啶均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用試劑均為分析純，未經(jīng)處理直接使用。所用實驗用水均為三重蒸餾水。

電化學測量在CHI 660D電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)上完成，采用三電極體系：MIP修飾的玻碳電極(GCE)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，Pt絲為輔助電極。

1.2 MIP的合成

對文獻方法稍加修改后合成MIP[13]。持續(xù)攪拌下，向4 mL異丙醇中依次加入200 μL TBOT、65 mg磺胺二甲嘧啶和75 mg甲氧芐啶，完全溶解后，再加入25 μL APTES和15 μL TiCl4。將混合液放置在水浴中，加熱到60 ℃反應1 h。然后將混合液移出水浴，室溫下繼續(xù)劇烈攪拌8 h。最后將反應液在8000 r/min離心10 min，所得產(chǎn)物在60 ℃干燥得到未洗脫的MIP。

將10 mg未洗脫的MIP加入到10 mL甲醇中攪拌30 min以脫去基質(zhì)中印跡的磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶，真空干燥后即得到MIP。將該MIP分散于水中制成2 mg/mL的分散液備用。作為對比，在不加模板分子磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的情況下，用同樣的方法制得非印跡聚合物(NIP)。

1.3 傳感器的制備

將直徑為3 mm的GCE在拋光板上用Al2O3漿打磨1 min，然后分別在體積比為1∶1的乙醇/水混合液和水中各超聲1 min，最后用N2吹干。取10 μL上述MIP水分散液滴涂在處理好的GCE表面，并在紅外線燈下烤干，即制得MIP/GCE。將MIP/GCE浸泡在含30 μmol/L磺胺二甲嘧啶和50 μmol/L甲氧芐啶的水溶液中4 h可進行兩種物質(zhì)的重吸附，并將其標記為MIP/GCE-重吸附。其他修飾電極采用相似的方法制備。

1.4 樣品預處理

選擇湖水、土壤、生菜、雞肉、豬肉和魚肉樣品考察該傳感器的實用性。環(huán)境樣品取自信陽本地，農(nóng)產(chǎn)品購自本地超市。湖水樣品過濾后直接使用。風干且過篩后的土壤樣品(10.0 g)與乙腈(50 mL)混合，分別震蕩和超聲萃取5 min后將分散液過濾，保留上清液并定容至50 mL備用。稱量25 g切碎的生菜樣品置于三角瓶中，加入50 mL乙腈后分別超聲和震蕩萃取30 min，過濾后取上清液定容至50 mL備用。參照文獻[14-15]方法進行肉類樣品的預處理：將5.0 g攪碎后的雞肉、豬肉和魚肉與15 mL乙腈混合并超聲提取20 min，過濾后保留萃取液進行測定。

1.5 電化學測定

DPV是一種精確度較高的伏安測量法，具有高靈敏度和高分辨率的優(yōu)點，適用于電化學定量分析。以pH5.0的HAc-NaAc緩沖液為測定電解質(zhì)，記錄0.60～1.35 V之間的DPV曲線，分別測量0.96和1.16 V電位處的氧化峰電流作為磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的分析信號。所有電化學測量均在室溫下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的電化學表征

通過EIS研究了電極與電解液的界面特性(圖1)，并采用Randles等效電路(圖1的內(nèi)插圖)對阻抗復平面圖進行模擬以確定電極體系的電荷傳遞電阻Rct。由圖1可知，裸GCE的Rct值較大，為1047 Ω(曲線a)，表明電子轉(zhuǎn)移速率較低。用未洗脫MIP修飾GCE后，致密且不導電的聚合物膜阻礙了探針分子向電極表面的擴散，導致Rct增加至3140 Ω(曲線b)。將聚合物中的模板分子去除后，形成了大量利于K3[Fe(CN)6]信號分子有效擴散的印跡空腔，在MIP/GCE上觀察到EIS的半圓直徑大幅下降，Rct值降至436 Ω(曲線c)。當MIP/GCE重吸附磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶后，部分印跡空穴被占據(jù)，再次阻礙了氧化還原探針向電極界面的擴散，致使Rct值增大至872 Ω(曲線d)。以上結(jié)果證實了分子印跡電化學傳感器的成功制備以及良好的識別性能。

圖1 裸GCE(a)、未洗脫MIP/GCE(b)、MIP/GCE(c)和 MIP/GCE-重吸附(d)在含5 mmol/L K3Fe(CN)6的 0.1 mol/L KCl溶液中的EIS曲線Fig. 1 EIS of bare GCE (a), uncoated MIP/GCE (b), MIP/GCE (c), and MIP/GCE-readsorption (d) in 0.1 mol/L KCl containing 5 mmol/L K3Fe(CN)6

在含10 mmol/L K3Fe(CN)6的1.0 mol/L KCl溶液中，采用CV法考察了不同修飾電極的電化學性能，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，與裸電極(曲線a)相比，未洗脫MIP/GCE上K3Fe(CN)6的氧化還原峰電流明顯減弱(曲線b)，而洗脫后的MIP提供了大量印跡孔穴和擴散通道，探針分子在MIP/GCE上的氧化還原電流得到增強(曲線c)。此外，將MIP/GCE在含30 μmol/L磺胺二甲嘧啶和50 μmol/L甲氧芐啶的溶液中浸泡4 h后，被再次占據(jù)的印跡孔穴導致K3Fe(CN)6的氧化還原峰電流明顯減小(曲線d)，這些結(jié)果與圖1中EIS結(jié)果相吻合，再次表明MIP對磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶具有良好的識別性能。

圖2 1.0 mol/L KCl溶液中，10 mmol/L K3[Fe(CN)6]在 裸GCE(a)、未洗脫MIP/GCE(b)、MIP/GCE(c)和 MIP/GCE-重吸附(d)上的CV圖(掃描速率為100 mV/s)Fig. 2 CVs of the bare GCE (a), uncoated MIP/GCE (b), MIP/GCE (c), and MIP/GCE-readsorption (d) in 1.0 mol/L KCl containing 10 mmol/L K3[Fe(CN)6](Scan rate is 100 mV/s)

采用DPV方法研究了不同電極在pH5.0 HAc-NaAc緩沖液中的電化學行為(圖3A)。在未洗脫MIP/GCE上(曲線a)，分別于0.96 V和1.16 V出現(xiàn)對應于磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰，它們的氧化峰電流分別為2.13和1.81 μA，氧化峰電位之差達200 mV，證明兩種抗生素已成功地印跡在MIP中且可以實現(xiàn)同時檢測。去除模板分子后，MIP/GCE在空白溶液中的DPV圖觀察不到磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰(曲線b)，表明甲醇的洗脫可以有效解除模板分子和功能單體之前的結(jié)合，從而在MIP基質(zhì)中留下特定的結(jié)合位點和特定結(jié)構(gòu)的孔穴。然后，將MIP/GCE在磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶混合液中浸泡4 h后(曲線c)，兩者的氧化峰又恢復，說明MIP/GCE對磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶分子具有良好的親和力。對于NIP/GCE而言，聚合物膜中沒有模板分子，曲線d平滑無峰，因此這兩處峰是屬于磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的。

圖3 (A)未洗脫MIP/GCE(a)、MIP/GCE(b)、 MIP/GCE-重吸附(c)和NIP/GCE(d) 在pH5.0 HAc-NaAc中的DPV比較圖 (B)30 μmol/L磺胺二甲嘧啶和40 μmol/L甲氧芐啶 在裸GCE(e)和MIP/GCE(f)上的DPV比較圖Fig. 3 (A) Differential pulse voltammograms of uncoated MIP/GCE (a), MIP/GCE (b), MIP/GCE-readsorption (c), and NIP/GCE (d) in pH5.0 HAc-NaAc (B) Differential pulse voltammograms of 30 μmol/L sulfadimidine and 40 μmol/L trimethoprim on the GCE (e) and MIP/GCE (f) in pH5.0 HAc-NaAc

同時，研究了pH5.0 HAc-NaAc緩沖液中30 μmol/L磺胺二甲嘧啶和40 μmol/L甲氧芐啶在裸GCE和MIP/GCE上的DPV行為(圖3B)。在裸GCE上，磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電流分別為1.15 μA和1.12 μA。與之相比，兩者在MIP/GCE上的氧化峰電流顯著增加，這是因為MIP膜上有大量的印跡位點，可有效增加磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶在電極表面的富集量。

2.2 條件優(yōu)化

首先，研究了聚合過程中APTES功能單體的用量對傳感器性能的影響。當APTES的量增加時，識別模板分子的功能基團數(shù)目增加，所以兩種抗生素的氧化峰電流逐漸增大；當APTES的量為25 μL時，兩種抗生素的氧化峰電流均達到最大；隨著APTES量的繼續(xù)增加，功能單體會自聚集且會形成復雜的印跡孔穴，反而使得兩種抗生素的氧化峰電流減小。所以，APTES的最優(yōu)量為25 μL。

對TBOT的用量也做了優(yōu)化。分別向聚合液中加入不同量的TBOT，并對所得MIP修飾電極的電化學信號進行了比較，發(fā)現(xiàn)TBOT的體積為200 μL時兩種抗生素的氧化峰電流最大。當TBOT的量過低時，所形成的聚合物密度太小，難以形成有效的印跡孔穴；當TBOT的量過大時，高密度的聚合物會阻礙模板分子與功能單體的結(jié)合。所以選擇加入200 μL TBOT制備MIP。

印跡過程中模板分子的量對傳感器的測定靈敏度也有影響。隨著模板分子量的增加，MIP基質(zhì)中識別位點的數(shù)目增加，兩種抗生素在該傳感器上的響應信號增強。而當模板分子的量過大時，MIP基質(zhì)內(nèi)部孔穴結(jié)構(gòu)越發(fā)復雜，不利于模板分子的識別。最終，確定磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的加入量分別為65和75 mg，此時可以得到兩者最佳的電化學氧化信號。

然后，在制備MIP時加入5～20 μL的TiCl4，考察TiCl4對傳感器性能的影響。發(fā)現(xiàn)當TiCl4的加入量為15 μL時磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電流達到最大，表明TiCl4的最優(yōu)體積為15 μL。

分別以乙腈、水、甲醇、乙醇和甲醇/水(1∶1，V/V)為洗脫劑，發(fā)現(xiàn)在甲醇中洗脫的最為徹底，在DPV曲線上幾乎無法檢測到兩種抗生素的氧化峰。在1～50 min范圍內(nèi)繼續(xù)考察甲醇中的浸泡時間對洗脫效果的影響。結(jié)果表明，當洗脫時間達到30 min時，磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電流幾乎為零，此時印跡位點已完全暴露，所以將聚合物浸泡在甲醇中30 min以洗脫磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶。

最后，對重吸附時間進行了優(yōu)化。將MIP/GCE在30 μmol/L磺胺二甲嘧啶和50 μmol/L甲氧芐啶溶液中浸泡不同時間(1～6 h)后，發(fā)現(xiàn)磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電流隨著浸泡時間的增加而增大，當浸泡至4 h后，兩者的峰電流基本保持不變，表明MIP膜中兩種物質(zhì)的吸附已達到飽和，故將MIP/GCE在模板分子溶液中浸泡4 h進行重吸附。

2.3 電化學氧化機理

研究了不同掃速下pH5.0 HAc-NaAc緩沖液中0.5 mmol/L磺胺二甲嘧啶(圖4A)和甲氧芐啶(圖4B)在MIP/GCE上的CV行為。如圖4內(nèi)插圖所示，磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電流(Ip)在50～200 mV/s的范圍內(nèi)隨著掃速(ν)的增加而增大，線性回歸方程分別為Ip=0.058 9ν +6.833(R=0.998)和Ip=0.125ν+18.315(R=0.996)，說明磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化過程是受吸附控制的過程。同時，磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電位(Ep)均隨ν的增加而正移(圖4內(nèi)插圖)，Ep與lnν之間的線性關系分別為Ep=0.023 5lnν+0.889(R=0.995)和Ep=0.013 3lnν+1.157(R=0.996)。根據(jù)Laviron方程[16]：

(1)

式中：k0為表面反應的標準速率常數(shù)，E0是標準電極電位，n為反應中涉及到的電子數(shù)，α是電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)。對于受吸附控制的不可逆過程，α值通常取0.5，由此根據(jù)方程(1)的斜率計算出n分別為2和4。因此，磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的電化學氧化過程分別為2電子和4電子參與的過程，電化學反應機理如方程(2)和(3)所示。

圖4 在pH5.0 HAc-NaAc中，不同掃速下0.5 mmol/L 磺胺二甲嘧啶(A)和甲氧芐啶(B)在MIP/GCE上的CV曲線， 從下至上的掃速分別為50、75、100、125、150、175和200 mV/s 內(nèi)插圖為Ip與ν以及Ep與ln ν之間的線性關系Fig. 4 CV curves of 0.5 mmol/L sulfadimidine and trimethoprim on MIP/GCE in pH5.0 HAc-NaAc buffer with different scan rates of 50, 75, 100, 125, 150, 175, and 200 mV/s (from bottom to top) Insets: plots of Ip vs. ν and Ep vs. ln ν

磺胺二甲嘧啶 (2)

甲氧芐啶 (3)

2.4 分析性能

在優(yōu)化條件下，研究了該傳感器測定磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的分析性能，結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH5.0 HAc-NaAc中，50 μmol/L甲氧芐啶和 不同濃度的磺胺二甲嘧啶(A)、50 μmol/L磺胺二甲嘧啶和 不同濃度的甲氧芐啶(B)在MIP/GCE上的DPV曲線 內(nèi)插圖為相應的Ip與c的關系Fig. 5 DPVs of pH5.0 HAc-NaAc at MIP/GCE in 50 μmol/L trimethoprim and different concentrations of sulfadimidine (A), 50 μmol/L sulfadimidine and different concentrations of trimethoprim (B) Insets: plots of Ip vs. c

將甲氧芐啶的濃度固定為50.0 μmol/L，從0.8到50.0 μmol/L逐漸增加磺胺二甲嘧啶的濃度，從圖5A中可以看出，磺胺二甲嘧啶的陽極峰電流逐漸增大，而甲氧芐啶的峰電流幾乎沒有變化?；前范奏奏さ姆咫娏髋c濃度成良好線性關系：Ip=0.035 3c+0.042 7(R=0.996)，檢出限為0.14 μmol/L(RSN=3)。然后，將磺胺二甲嘧啶的濃度固定為50.0 μmol/L，而甲氧芐啶的濃度從1.0 μmol/L增加到50.0 μmol/L，圖5B顯示甲氧芐啶的陽極峰電流逐漸增大(Ip=0.024 8c+0.104，R= 0.997)，而磺胺二甲嘧啶的峰電流幾乎沒有變化，檢測甲氧芐啶的檢出限為0.26 μmol/L(RSN=3)。

接下來，考察結(jié)構(gòu)類似物對1.0 μmol/L磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶測定的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 該分子印跡電化學傳感器的抗干擾性能Tab. 1 Anti-interference ability of the molecularly imprinted electrochemical sensor

由表1可以看出，50倍酞磺醋胺、5倍磺胺脒和3.3倍柳氮磺吡啶存在時，兩種分析物的電化學氧化信號變化均小于8%，說明它們對磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的測定基本沒有影響。還考察了樣品中可能存在的無機離子和有機物對測定的干擾，結(jié)果表明，2000倍的Na+、Fe3+、Zn2+、Cl-、葡萄糖、果酸，1500倍的Ca2+、Al3+，1000倍的K+、Mg2+、Cu2+、NO3-、SO42-、蔗糖，以及100倍的檸檬酸共存時，都不會干擾兩種抗生素的測定信號，證明該分子印跡電化學傳感器具有良好的抗干擾能力。

將MIP/GCE在含30.0 μmol/L磺胺二甲嘧啶和50.0 μmol/L甲氧芐啶的溶液中重吸附后測定pH5.0 HAc-NaAc中兩種抗生素的氧化信號，并于每次測定后洗脫除去模板分子。如此重復10次所得響應信號的相對標準偏差(RSD)分別為2.8%和3.8%，表明該傳感器至少可以重復使用10次。將單根MIP/GCE在室溫干燥環(huán)境中儲存28 d，每隔4 d檢測1次，觀察到兩種抗生素的氧化峰電流沒有明顯改變。28 d后磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的氧化峰電流仍能保留其原始響應信號的97.8%和96.9%，表明該傳感器具有長期穩(wěn)定性。而且，磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶在10根MIP/GCE上氧化峰電流的RSD分別為4.9%和3.7%，說明該傳感器具有良好的重復性。

2.5 實際應用

為了評估該傳感器的實際應用價值，將其用于湖水、土壤、生菜、雞肉、豬肉和魚肉樣品中磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的加標回收測定，所有數(shù)據(jù)均為6次平行測定的平均值，測定結(jié)果如表2所示。測定樣品的RSD值小于4%，加標回收率介于91.20%～103.44%，說明所構(gòu)建的傳感器具有較高的準確度，可應用于實際樣品中磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的分析。

表2 實際樣品中磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的測定Tab. 2 The detection of sulfadimidine and trimethoprim in real samples

3 結(jié)論

本文以磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶為雙模板分子，采用溶膠-凝膠法制備了分子印跡聚合物，基于該分子印跡聚合物構(gòu)建了可以特異性識別磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的分子印跡電化學傳感器。結(jié)果表明，該傳感器特異性強、靈敏度較高，可用于實際樣品中磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶的定量準確檢測。本文建立的傳感器有望為其他抗生素的多元分析提供一種高效的檢測手段。