陳 鑫，李曦冉，楊姣姣

（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070）

植物內(nèi)生菌是在植物生活史的部分及全部階段，存在于植物不同組織中并和宿主植物建立互惠共生的一類微生物［1］。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），在植物生長發(fā)育中直接促進植物的生長［2］。近年來，不同植物內(nèi)生菌逐漸成為農(nóng)業(yè)等領域的研究熱點［3］。傅本重等［4］發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)生細菌可以抑制病原真菌，促進種子的萌發(fā)。陳世萍等［5］發(fā)現(xiàn)室溫水分脅迫下內(nèi)生真菌感染可以提高黑麥草超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性。沙棘（H.rhamnoides）廣泛分布于我國干旱與半干旱地區(qū)，其根系發(fā)達，能夠生長在環(huán)境嚴酷、不同海拔的干燥寒冷的貧瘠地區(qū)［6］，可作為水土流失嚴重、干旱貧瘠地區(qū)的先鋒樹種，改善土壤環(huán)境［7］。目前國內(nèi)對于沙棘內(nèi)生菌的研究較少，本課題組發(fā)現(xiàn)［8］沙棘除了在根瘤中存在內(nèi)生細菌，沙棘種子中也含有豐富的內(nèi)生菌資源。

蘭州地處甘肅省中部，由于受到西北獨特氣候環(huán)境等影響，蘭州北山植被覆蓋率較低。蘭州北山植物綠化主要靠人工栽植［9］，植物種子繁殖因受到土壤等環(huán)境的限制，萌發(fā)率較低，植株幼苗的生長繁殖也受到一定限制。本實驗選取北山具有綠化價值的喬木、闊葉類灌木和藤本、草本四類植物種子［10］，共13 種作為實驗材料，通過沙棘種子中篩選出產(chǎn)IAA 能力強的內(nèi)生菌，深入研究沙棘種子內(nèi)生菌的促生能力，探究其對甘肅蘭州北山常見的植物種子萌發(fā)的影響，促進其種子繁殖，以期為蘭州北山綠化提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試的17 株沙棘種子內(nèi)生細菌由張愛梅等采用純培養(yǎng)法分離自甘肅省榆中縣馬銜山的野生中國沙棘種子樣品中，于4℃甘油管中保存。純化后菌株編號分別為H1B01、F2B04、G2B03、D2B03、J2B04、G2B05、D2B12、D1B01、F3B01、J3B02、F2B01、A1B08、H3B05、H2B03、G3B06、J2B05、J3B10。

1.1.2 供試種子

供試植物種子共13 種，分別是角茴香（H.erectum）、細葉韭（A.tenuissimum）、寧夏枸杞（L.barbarum）、鵝絨藤（C.chinenese）、曼陀羅（D.stramonium）、灌木鐵線蓮（C.fruticosa）、波斯菊（C. bipinnata）、五葉地錦（P.quinquefolia）、牽牛花（P.nil）、臭椿（A. altissima）、刺槐（R.pseudoacacia）、側(cè)柏（P.orientalis）、沙棗（E.angustifolia），以上材料均以五點取樣法采樣于蘭州北山西北師范大學新校區(qū)北山段。試驗前將各植物種子置于室溫通風保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘種子內(nèi)生細菌產(chǎn)IAA菌株的篩選

采用Salkowski 比色法［11］測定沙棘種子內(nèi)生細菌IAA的產(chǎn)量。

（1）定性測定：將沙棘種子內(nèi)生細菌接種到150 mL的三角瓶中。在37℃200 r·min-1的條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)1 d 之后以1%接種量接種到含有500 mg·L-1色氨酸的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以無菌水為對照組，37℃180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)3 d。最后，將發(fā)酵液7000 r·min-1離心5 min，取50uL 上清液于白瓷板中，向其加入100uL 的IAA 顯色劑，兩者充分混合，置于黑暗條件下避光反應30 min，觀察其顏色變化。如出現(xiàn)粉紅色，則說明菌株呈陽性，有IAA產(chǎn)生。

（2）定量測定：取2 mL 陽性菌株上清液于試管中，向其加入4 mL 的IAA 顯色劑，每組3 個重復，黑暗條件下避光反應30 min，測定其在530nm 的吸光值，以無菌水為對照組。以純IAA 繪制標準曲線測定各菌株IAA的產(chǎn)量［12］。

（3）IAA 標準曲線的繪制［11］：以純吲哚乙酸，分別配置0.5 、1.0 、1.5 、2.0、2.5 mg·L-1的吲哚乙酸溶液，在530 nm 處分別測定其吸光值。以IAA 標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，530nm 吸光值（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到IAA 標準曲線回歸方程為y=0.036 4x+0.040 1，相關系數(shù)為R2=0.999 0。

1.2.2 內(nèi)生細菌發(fā)酵液的制備

將菌株接種到三角瓶中，37℃200 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)24 h 之后以1%接種量接種到含有色氨酸的牛肉膏蛋白液體培養(yǎng)基中，使色氨酸的濃度為500 mg·L-1，37℃180 r·min-1恒 溫 震 蕩 培 養(yǎng)36 h備用。

以開放化、平臺化的思想進行系統(tǒng)的功能和架構(gòu)設計，通過統(tǒng)一的訪問接口，以RDF等標準的數(shù)據(jù)描述格式，將圖書館的館藏資源和信息檢索服務對外開放，方便讀者對圖書館館藏資源的深度利用。同時，平臺化的設計思想也為以資源開發(fā)和利用為主要目標的第三代圖書館服務平臺的建設提供了更加靈活的架構(gòu)。

1.2.3 種子預處理

將曼陀羅、刺槐、沙棗、角茴香、細葉韭、五葉地錦和臭椿［13］七種種皮較厚的種子用50℃的溫水浸泡24 h，然后用自來水將13 種種子沖洗干凈備用。加入75%的乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3～4 次，再加入1%NaClO 浸泡5 min，無菌水沖洗3～4次，對各植物種子進行表面消毒。最后從每類植物中分別選取大小均一、飽滿的種子，置于無菌水中浸種24 h。

1.2.4 內(nèi)生細菌對植物種子萌發(fā)的影響

所有種子于超凈臺上進行種皮表面自然風干后，置于墊有雙層濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中。每皿10 粒，每個處理做三次重復。該試驗分為兩個實驗組和一個對照組，即①無菌對照組，②含菌發(fā)酵液處理組，③發(fā)酵液的上清液處理組。①②③組均用無菌水浸種24 h，萌發(fā)過程中，對照組①補充無菌水，試驗組②補充含菌的發(fā)酵液，實驗組③補充發(fā)酵液上清液。除曼陀羅種子進行全黑暗條件處理［14］外，其他12 種植物種子每天光照12 h。臭椿、灌木鐵線蓮、沙棗種子于15℃恒溫培養(yǎng)15 d［15］，其余10 種種子25℃下恒溫培養(yǎng)15 d，每天定時記錄各組試驗的發(fā)芽情況。萌發(fā)指標以種子吐白為準，測定其發(fā)芽率、發(fā)芽勢［16］，計算公式如下：

發(fā)芽率（%）=第15 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢（%）=第4 天種子的發(fā)芽率/供試種子總數(shù)×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS21.0 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Origin7.5進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘種子內(nèi)生細菌產(chǎn)IAA內(nèi)生菌的篩選

通過Salkowski 比色法對分泌IAA 的沙棘種子內(nèi)生細菌進行篩選。在定性測定中，17 株內(nèi)生細菌產(chǎn)IAA 的顯色反應如圖1 所示，其中6 株菌呈陽性，分別是菌株H2B03、A1B08、H3B05、F2B01、F3B01、D2B12，菌株H2B03顯色反應最為明顯。

圖1 17株供試菌的顯色反應Fig.1 Chromogenic reaction of 17 tested strains

通過定性測定篩選出6 株陽性菌，對其進行產(chǎn)IAA 的定量測定。結(jié)果顯示，顯色反應最為明顯的菌株H2B03，其IAA 產(chǎn)量最高，為22.15 μg·mL-1（表1），此時的菌液濃度為1.56×109CFU·mL-1。菌株H3B05 的IAA 產(chǎn)量最低，為1.52 μg·mL-1，其余4 株菌IAA產(chǎn)量均低于4.00 μg·mL-1。因此，在后續(xù)的試驗中，選取菌株H2B03進行種子萌發(fā)試驗。

表1 6株供試菌產(chǎn)IAA量Table 1 IAA yield of 6 tested strains

2.2 種子萌發(fā)試驗

2.2.1 兩種處理下不同植物種子的萌發(fā)狀況

采用IAA 產(chǎn)量最高的菌株H2B03 分別對13 種植物種子進行萌發(fā)試驗，通過H2B03 上清液處理和發(fā)酵液處理，試驗結(jié)果如圖2 所示。13 種植物種子具有普遍發(fā)芽率較低的情況，其中臭椿、灌木鐵線蓮、角茴香、沙棗和曼陀羅5種植物種子在萌發(fā)試驗中不發(fā)芽；除細葉韭、五葉地錦種子外，寧夏枸杞、側(cè)柏、鵝絨藤、波斯菊、刺槐和牽?；? 種種子的萌發(fā)指標在兩種處理下相對于無菌對照組均有降低的趨勢?？梢?，菌株H2B03 對寧夏枸杞、鵝絨藤、波斯菊、刺槐、牽?；? 種種子的萌發(fā)具有抑制作用，但對細葉韭、五葉地錦有一定的促進作用。

2.2.2 兩種處理對同一種植物種子萌發(fā)的影響

用菌株H2B03 分別對13 種植物種子進行上清液處理和發(fā)酵液處理，測定H2B03 的兩種處理對同一種子萌發(fā)的影響（表2）。不同植物種子的萌發(fā)因?qū)Σ煌奶幚砻舾行圆煌?。臭椿、灌木鐵線蓮、角茴香、沙棗和曼陀羅在各處理下均不發(fā)芽；上清液處理中：側(cè)柏的發(fā)芽率（20.5%）、發(fā)芽勢（19.6%）明顯低于對照組的發(fā)芽率（72.1%）、發(fā)芽勢（41.6%）P＜0.05，細葉韭發(fā)芽率相比于對照組提高了31.3%，五葉地錦的發(fā)芽率相比于對照組提高了9.5%；發(fā)酵液處理中：只有細葉韭種子萌發(fā)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別為21.2%、20.0%，均低于上清液處理的發(fā)芽率（31.3%）、發(fā)芽勢（30.1%）。

2.2.3 同一處理對不同植物種子萌發(fā)的影響

從表2 可以看出，通過菌株H2B03 對13 種植物種子分別進行上清液處理和發(fā)酵液處理，同一種處理下不同種子間的萌發(fā)狀況有很大的差異（P＜0.05）。在上清液處理下，只有細葉韭、側(cè)柏、五葉地錦種子有發(fā)芽的趨勢，發(fā)芽率分別為31.3%、20.5%、9.5%；在發(fā)酵液處理下，除細葉韭外，寧夏枸杞、側(cè)柏、鵝絨藤、波斯菊、刺槐、牽?；ê臀迦~地錦種子無萌發(fā)的跡象。其中細葉韭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別為21.2%、20.0%。

3 討論

本試驗從17 株沙棘種子內(nèi)生細菌中篩選到6株產(chǎn)IAA 的菌株，各菌株IAA 的分泌量為1.52～22.15 μg·mL-1，其分泌量最高的菌株是H2B03。不同植物的內(nèi)生細菌分泌IAA 的量有一定的差異，丁森等［17］從櫻花體內(nèi)分離到一株瓦雷茲芽孢桿菌，其在第七天IAA 的生成量為9.174 μg·mL-1；而劉琳等［18］從春蘭根組織中獲得57 株分泌IAA 內(nèi)生細菌，其IAA 分泌量為0.50～129.68 μg·mL-1。采用菌株H2B03的發(fā)酵上清液處理和含菌發(fā)酵液對采摘于蘭州北山的種子進行萌發(fā)試驗。結(jié)果表明，臭椿、灌木鐵線蓮、角茴香、沙棗和曼陀羅種子在兩種處理下均不發(fā)芽。原因可能與四方面因素有關，第一，這幾種植物種皮較厚，透水透氣性低，且角茴香、曼陀羅種子表面存在蠟狀膠質(zhì)，不利于種子吸收水分［19］；第二，也可能是因為這幾種植物種子萌發(fā)周期較長，需適當延長其萌發(fā)時間；第三，這幾種植物種子沒有經(jīng)過自然界冬季的低溫處理，其發(fā)芽率降低。研究發(fā)現(xiàn)，冬季過低的氣溫以及較大的溫度變幅（-26℃～10℃）可以使部分種子萌發(fā)率升高［20］；第四，種子休眠未被打破。Baskin 將種子休眠分為生理休眠等5種類型，針對不同類型的休眠，其打破休眠的方式各有不同［21］。本試驗為了控制變量，針對種皮較厚的種子統(tǒng)一使用了物理方式（50℃溫水浸泡24 h）處理，這可能也是種子不萌發(fā)的原因之一。

IAA 作為一種植物生長激素，對不同植物種子的萌發(fā)及生長均有最適處理范圍，濃度過低促進作用不明顯，濃度過高則表現(xiàn)為抑制生長［22］。本文中分離自沙棘種子的內(nèi)生菌產(chǎn)生的IAA的濃度不利于寧夏枸杞等6 種植物種子的萌發(fā)，且菌株H2B03 發(fā)酵液中，可能含有的代謝產(chǎn)物也會抑制種子的萌發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)，木麻黃林地特有細菌代謝產(chǎn)物對青皮、紅厚殼和楊葉肖槿種子萌發(fā)均有抑制作用［23］。此外代謝產(chǎn)物的濃度也可能是抑制種子萌發(fā)的原因之一，蔣先軍等［24］研究表明，細菌代謝產(chǎn)物對植物生長的刺激作用與濃度有關，如高濃度的硅酸鹽細菌代謝產(chǎn)物對植物生長有一定的抑制作用，且對根系生長的影響尤為明顯。

本試驗中，H2B03 上清液處理對細葉韭和五葉地錦種子的萌發(fā)有一定的促進作用。其中細葉韭種子的萌發(fā)率（31.3%）顯著高于對照組（P＜0.05），五葉地錦相比于對照組發(fā)芽率提高到了9.5%。有研究發(fā)現(xiàn)，剛采收的內(nèi)蒙古地區(qū)野生細葉韭植物種子的萌發(fā)率極低，存在自然休眠期，最高萌發(fā)率只有25.5%，貯藏7 個月后在適合的萌發(fā)條件下，其萌發(fā)率能達到98.0%［25］。本試驗采集的細葉韭在室溫下只儲存了2個月，萌發(fā)率達到31.3%，可見，H2B03發(fā)酵液的上清液處理有利于打破細葉韭種子休眠。本試驗研究結(jié)果表明，如采用菌液H2B03 對細葉韭和五葉地錦種子進行處理，將會促進細葉韭和五葉地錦兩種植物種子的萌發(fā)，促進種子繁殖，有利于蘭州城市綠化。