楊琳懿，趙文植，辛靜，董章宏，馬路遙，李衛(wèi)英，王飛，辛培堯

(1.西南林業(yè)大學(xué) 國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

葉綠體是植物細(xì)胞內(nèi)重要的質(zhì)體，是進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，其基因組功能與光合作用密切相關(guān)[1]。葉綠體擁有一套完整的基因組，其結(jié)構(gòu)大多數(shù)為閉合雙鏈環(huán)狀(傘藻除外)，由四部分組成，2個(gè)反向重復(fù)區(qū)將大、小單拷貝區(qū)分隔開(kāi)。其遺傳方式大多屬母系遺傳[2]，基因組結(jié)構(gòu)組成相對(duì)保守，適用于植物系統(tǒng)發(fā)育方面的研究，一般IR區(qū)是葉綠體基因組最保守的區(qū)域，LSC區(qū)的進(jìn)化速率最快[3]，編碼區(qū)變異程度低于非編碼區(qū)，不同進(jìn)化速率的序列適用于不同階元的系統(tǒng)發(fā)育研究[4]。目前越來(lái)越多物種的葉綠體基因組被測(cè)定研究，其已成為遺傳多樣性分析、構(gòu)建和分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的有力工具，來(lái)進(jìn)行不同物種間的比較研究[5-6]。

光葉子花(BougainvilleaglabraChoisy)別名三角梅、簕杜鵑等，系紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(Bougainvillea)木質(zhì)藤本狀灌木，原產(chǎn)南美洲的巴西，后逐漸引種栽培至我國(guó)福建、兩廣、云南等地，是重要的觀賞花卉和優(yōu)良的園林綠化植物，我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)露地種植，以北地區(qū)只能溫室栽培[7-8]。光葉子花觀賞價(jià)值極高，另外耐性強(qiáng)，易管理，還可應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境修復(fù)，除此以外，其藥用價(jià)值也在被進(jìn)一步挖掘。

紫茉莉科是石竹亞綱(Caryophyllidae)石竹目(Caryophyllales)的一科，在我國(guó)有7屬11種，自生有腺果藤屬(Pisonia)、黃細(xì)心屬(Boerhavia)等植物，引種的有葉子花(B.spectabilis)和光葉子花[9]。現(xiàn)有的園藝品種多為光葉子花、葉子花和秘魯葉子花(B.peruviana)3個(gè)原種及其雜交和變異的后代，此3種已成為栽培品種主要的育種親本[10-11]。目前，紫茉莉科植物的研究主要集中在資源調(diào)查[12-13]、組織培養(yǎng)[14-15]、藥用價(jià)值[16]、形態(tài)學(xué)研究[17]等方面，此外Yuan等[18]研究了藥用植物喜馬拉雅紫茉莉(Mirabilishimalaica)葉綠體基因組的完整序列。邱胤暉利用生物信息學(xué)技術(shù)，闡明了三角梅苞片色澤形成和成花的分子機(jī)制[19]。張玲玲利用分子標(biāo)記技術(shù)，為三角梅的品種分類和種質(zhì)資源的保護(hù)提供了技術(shù)支持[20]。孫利娜等[21]基于ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建了葉子花親緣關(guān)系分析和指紋圖譜，為品種鑒定及遺傳多樣性提供了有力支撐。Wang等[22]對(duì)西藏(山南和林芝)和四川(甘孜)的喜馬拉雅紫茉莉3個(gè)樣本進(jìn)行了完整的葉綠體基因組測(cè)序，并與其他幾種紫茉莉科植物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，結(jié)果顯示此3種互為姐妹類群，且和紫茉莉聚在同一支上，支持率為100%。另外，紫茉莉科葉子花屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖表明同屬植物支持率更高[23]。這些都為紫茉莉科甚至石竹目植物的分類提供了理論支撐。本研究利用生物信息學(xué)手段對(duì)紫茉莉科9個(gè)種的葉綠體基因組進(jìn)行特征分析，結(jié)果可為紫茉莉科植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究和物種鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已公布的石竹目12個(gè)種的葉綠體基因組序列用作分析，其中9個(gè)種為紫茉莉科，2個(gè)種為石竹科(Caryophyllaceae)，1個(gè)種為莧科(Amaranthaceae)。GenBank登錄號(hào)分別為：MN449976光葉子花(B.glabra)；MN315508葉子花(B.spectabilis)；MT407463秘魯葉子花(B.peruviana)；MW123902厚葉子花(B.pachyphylla)；MW123903(B.hybrid)；MN711726黃細(xì)心(Boerhaviadiffusa)；MH286318夜茉莉(Nyctaginiacapitata)；MH286321(Acleisanthesobtusa)；MN548769喜馬拉雅紫茉莉(M.himalaica)；JF715055叉枝蠅子草(Silenelatifolia)；NC035226頭序蠅子草(S.capitata)；MG836505千穗谷(Amaranthushypochondriacus)。

1.2 葉綠體基因組序列比對(duì)分析

在Genious軟件中打開(kāi)這12個(gè)目標(biāo)序列，以光葉子花的近緣種植物秘魯葉子花為參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。在Geneious中校正注釋信息后，于MAFFT軟件進(jìn)行序列比對(duì)，再進(jìn)行手工校對(duì)，保存結(jié)果用于后續(xù)分析。將光葉子花的GenBank格式文件用DRAW Organel Genome Maps(OGDRAW)在線繪圖工具繪制出葉綠體基因組物理圖譜，并作葉綠體基因組注釋基因信息表。

1.3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

采用MISA軟件對(duì)紫茉莉科9個(gè)種的葉綠體基因組序列進(jìn)行微衛(wèi)星分析，參數(shù)設(shè)置為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5[24]。

1.4 IR區(qū)邊界的收縮與擴(kuò)張分析

利用IRSCOPE(https://irscope.shinyapps.io/irapp/)在線軟件，分析比較紫茉莉科9個(gè)親緣物種的IR邊界區(qū)的基因類型和基因分布情況，看是否存在明顯的收縮和擴(kuò)張。

1.5 核酸多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

使用Dnasp V6軟件計(jì)算紫茉莉科9種植物間的核苷酸多態(tài)性值(pi值)，窗口長(zhǎng)度設(shè)為600 bp，步長(zhǎng)設(shè)為200 bp；通過(guò)之前比對(duì)的數(shù)據(jù)，以JF715055叉枝蠅子草、NC035226頭序蠅子草和MG836505千穗谷為外類群，使用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將12條比對(duì)好的序列的.fasta格式文件用Geneious軟件轉(zhuǎn)化成.phy格式文件，將.phy文件放入iqtree軟件中，計(jì)算得到GTR+F+R2的模型建樹(shù)，再在figtree軟件中編輯樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基因比較

光葉子花，NCBI登錄號(hào)為MN449976，基因組大小為154 763 bp，平均GC含量為36.4%，由表1可知，紫茉莉科9個(gè)種的葉綠體基因組長(zhǎng)度在152 995～154 763 bp之間，它們都呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，LSC區(qū)長(zhǎng)度在83 700～88 100 bp之間，SSC區(qū)長(zhǎng)度在17 785～18 078 bp之間，IR區(qū)長(zhǎng)度在24 171～26 207 bp之間，雖然它們長(zhǎng)度不同，但基因數(shù)量和蛋白編碼數(shù)量相差無(wú)幾，rRNA和tRNA基因數(shù)相同(表1)。

表1 紫茉莉科9種植物葉綠體基因組比較

其中，光葉子花葉綠體基因組共有131個(gè)基因，86個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，8個(gè)rRNA基因和37個(gè)tRNA基因(表2)。其中，18個(gè)含有兩份拷貝基因，是4個(gè)rRNA基因(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)、7個(gè)tRNA基因(trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnR-ACG、trnA-UGC、trnN-GUU、trnV-GAC)和7個(gè)蛋白編碼基因(rps7、rpl23、rps12、ndhB、rpl2、ycf1、ycf2)。除此外還有21個(gè)基因含有內(nèi)含子，18個(gè)基因含有1個(gè)內(nèi)含子，包括6個(gè)tRNA基因(trnI-GAU、trnA-UGC、trnV-UAC、trnL-UAA、trnG-UCC、trnK-UUU)，8個(gè)蛋白編碼基因(ndhB、ndhA、rpl16、petD、petB、rpoC1、atpF、rps16)；3個(gè)基因(clpP、rps12、ycf3)則含有2個(gè)內(nèi)含子。其中trnI-GAU、trnA-UGC、ndhB為具有1個(gè)內(nèi)含子的雙拷貝基因，rps12為具有2個(gè)內(nèi)含子的雙拷貝基因(圖1)。

表2 光葉子花葉綠體基因組注釋基因信息

2.2 紫茉莉科9個(gè)種簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

利用MISA軟件分析可得，紫茉莉科9個(gè)種的葉綠體基因組中檢測(cè)到605個(gè)SSR位點(diǎn)，重復(fù)類型最多的是單核苷酸共582個(gè)，(A有218個(gè)、T有354個(gè)、G有10個(gè))，二核苷酸有20個(gè)(AT有4個(gè)、TA有16個(gè))，三核苷酸有3個(gè)(ATA、AAT、TTA，各為1個(gè))，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)四核苷酸及以上的重復(fù)類型，占SSR的總數(shù)分別為：96.2%、3.3%、0.5%。共有4種重復(fù)基元，其中優(yōu)勢(shì)基元是A/T，有572個(gè)，其次是AT/AT，20個(gè)，C/G，10個(gè)，AAT/ATT，3個(gè)，分別占SSR總數(shù)的94.5%、3.3%、1.7%和0.5%(圖2)。

2.3 紫茉莉科9個(gè)種葉綠體基因組IR邊界的收縮與擴(kuò)張分析

選取紫茉莉科9個(gè)種的葉綠體基因組進(jìn)行比較，分析光葉子花的IR邊界的收縮與擴(kuò)張情況，見(jiàn)圖3。

由圖3可知，除了黃細(xì)心和葉子花以外，其余7種的LSC/IRb邊界位于rps19基因編碼區(qū)，如光葉子花、厚葉子花、秘魯葉子花的rps19基因越過(guò)LSC/IRb邊界114 bp；喜馬拉雅紫茉莉、夜茉莉的rps19則越過(guò)29 bp和128 bp。在IRb/SSC邊界處，ndhF基因位于邊界靠近SSC側(cè)，光葉子花的ndhF基因越過(guò)邊界向IRb延伸了21 bp，其余大多延伸數(shù)值相同。在所有葉綠體基因組的IRb區(qū)域中，部分ycf1的拷貝與ndhF基因重疊。有8個(gè)種的ycf1片段在IRb/SSC邊界處有2 bp或4 bp的小延伸。SSC/IRa邊界常位于ycf1編碼序列中，光葉子花的ycf1越過(guò)邊界1 371 bp，其余略微有所差異。另外，trn-GUG常位于IRa/LSC的LSC一側(cè)，光葉子花距邊界22 bp，B.hybrid也距邊界22 bp，其余相近的秘魯葉子花、厚葉子花距離邊界17 bp。以上分析結(jié)果表明，紫茉莉科不同物種的葉綠體基因組IR邊界區(qū)的基因類型和基因分布情況存在一定差異，但相對(duì)比較保守。

2.4 紫茉莉科9種植物間的核苷酸多態(tài)性分析

用Dnasp V6軟件計(jì)算紫茉莉科9種植物間的核苷酸多態(tài)性值(pi值)，結(jié)果表明9個(gè)葉綠體基因組之間的pi值在0～0.107 59之間，平均值為0.024 03。pi>0.07時(shí)，檢測(cè)到6個(gè)高變區(qū)。其中LSC區(qū)檢測(cè)到4個(gè)：rps16-trnQ、rps4-trnL、ndhC-trnV、rps3-rpl22，SSC區(qū)檢測(cè)到2個(gè)：ndhF-rpl32、ycf1(圖4)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

12種植物的葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5知，外類群植物先被分離出來(lái)，其余的9種植物聚到2個(gè)進(jìn)化枝，葉子花屬的5個(gè)物種形成的分支形成姐妹關(guān)系，其中葉子花(登錄號(hào)：MN315508)及其栽培種B.hybrid(登錄號(hào)：MW123903)和光葉子花(登錄號(hào)：MN315508)、秘魯葉子花(登錄號(hào)：MN315508)和厚葉子花(登錄號(hào)：MN315508)互為姐妹類群，支持率都為100%。另一進(jìn)化枝上的Acleisanthesobtusa植物先被分離出來(lái)，其余夜茉莉、黃細(xì)心和喜馬拉雅紫茉莉3個(gè)物種形成的分支形成姐妹關(guān)系。

3 討論

通過(guò)對(duì)12種植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，基因組長(zhǎng)度從150 224 bp到154 763 bp，其基因結(jié)構(gòu)與基因內(nèi)容較為保守，它們編碼130個(gè)左右的基因(84～86個(gè)蛋白編碼基因，37個(gè)tRNA基因，8個(gè)rRNA基因)。IR區(qū)域重復(fù)的基因基本相同，有7個(gè)tRNA基因(trnl-CAU、trnV-GAU、trnL-CAA、trnA-UGC、trnl-GAU、trnR-ACG、trrN-GUU)、4個(gè)rRNA(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)、7個(gè)蛋白編碼基因(rps7、rp12、rps12、rpl23、ycf2、ndhB、ycf1)。其中LSC區(qū)的蛋白編碼基因accD在2個(gè)屬中丟失了，這可能是由于蛋白編碼基因的數(shù)量不同所導(dǎo)致的[25]。其中兩個(gè)基因ycf3和clpP含有2個(gè)內(nèi)含子，這與大部分被子植物葉綠體基因組相同[26]。總體來(lái)說(shuō)，紫茉莉科葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和特征基本相似，沒(méi)有觀察到基因順序或基因含量的顯著變化，這與Bautista等[25]在葉子花屬植物葉綠體基因組全序列的比較分析中的結(jié)果相一致。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)在植物葉綠體基因組中分布廣泛，信息含量大，具有高多態(tài)性，葉綠體基因組SSR以其獨(dú)特的母系遺傳優(yōu)勢(shì)被利用于鑒定親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育研究中[27-28]。它還是一種高效的分子標(biāo)記，有標(biāo)記數(shù)量豐富、重復(fù)性高及共顯性遺傳、相對(duì)保守等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于群體水平的遺傳差異分析和物種鑒定[29-30]。通過(guò)對(duì)紫茉莉科9個(gè)種的葉綠體基因組SSR分析發(fā)現(xiàn)，共有605個(gè)SSR位點(diǎn)，重復(fù)類型最多的是單核苷酸，優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元是A/T，未檢測(cè)到四核苷酸及以上的重復(fù)類型，但在Bautista等[25]的研究結(jié)果中，顯示單核苷酸和A/T豐富，不同的是其還檢測(cè)到了四核苷酸和五核苷酸，重復(fù)基元的類型也豐富些，造成些許差異的原因可能是SSR分析時(shí)在參數(shù)設(shè)置上有所不同，其設(shè)置的四核至六核苷酸重復(fù)數(shù)分別為3次。

IR區(qū)域的伸縮與擴(kuò)張?jiān)谘莼^(guò)程中起重要的作用[31-32]，可引起葉綠體基因組的大小變化。本研究中光葉子花的rps19基因向IRb延伸了114 bp，ycf1片段在IRb/SSC邊界處有2 bp的小延伸，在SSC/IRa邊界ycf1越過(guò)邊界1 371 bp，這些都與Bautista等[25]的研究結(jié)果一致?？梢?jiàn)，光葉子花和其他同科植物的葉綠體基因組IR邊界收縮與擴(kuò)張還是存在差異的，但還是相對(duì)保守的。和同屬植物之間比較不同的是，序列都屬于同一屬，偏移相對(duì)較小。

9個(gè)葉綠體基因組之間檢測(cè)到6個(gè)高變區(qū)，LSC區(qū)和SSC區(qū)的pi值明顯高于IR區(qū)，這可能與IR區(qū)域進(jìn)化的保守性有關(guān)[33]。其中蛋白編碼區(qū)ndhF、ycf1，非編碼區(qū)rps16-trnQ作為高可變區(qū)域在其他植物中也有報(bào)道，它們被認(rèn)為是潛在的分子標(biāo)記[34-35]。SSC區(qū)檢測(cè)到的2個(gè)高變區(qū)ndhF-rpl32和ycf1與Bautista等[25]的研究結(jié)果一致?；谌~綠體基因組的石竹目系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成的分支支持率均達(dá)100%，葉子花和B.hybrid處于同一分支上，B.hybrid其實(shí)是原產(chǎn)于印度的一個(gè)栽培品種，且這一分支又與光葉子花處于同一分支；秘魯葉子花和厚葉子為姐妹類群。根據(jù)之前的序列分析，我們可以觀察到這幾個(gè)種的序列差異較小，都屬于葉子花屬，因此在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中關(guān)系也更接近。Bautista等[25]對(duì)葉子花屬植物系統(tǒng)發(fā)育分析的研究中也是認(rèn)為葉子花及其變種與光葉子花的親緣關(guān)系更近。在光葉子花的葉綠體基因組研究中其與葉子花互為姐妹類群，二者關(guān)系更近[23,36]。在葉子花植物的葉綠體基因組系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究中，葉子花和番杏科(Aizoaceae)的番杏(Tetragoniatetragonoides)和冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)兩種植物聚在同一分支中，支持率為100%，莧屬(Amaranthus)、蠅子草屬(Silene)還有南漆姑屬(Colobanthus)中各自的2個(gè)物種互為姐妹類群,不同科間的植物在一個(gè)大的進(jìn)化枝上，支持率均為100%[37]。而在喜馬拉雅紫茉莉葉綠體基因組系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系中，支持率95%的進(jìn)化枝下，葉子花和紫茉莉?qū)僦参镆管岳蚝拖柴R拉雅紫茉莉互為姐妹關(guān)系。番杏科的番杏和冰葉日中花聚在一支，支持率為100%，且和紫茉莉科的其他植物聚在一個(gè)大的進(jìn)化枝下，支持率為100%[18]?？梢?jiàn)，研究者為了更好地探究葉子花和紫茉莉在紫茉莉科中的系統(tǒng)發(fā)育位置，對(duì)石竹目不同科植物間的葉綠體基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析，其結(jié)果顯示同屬植物更多的互為姐妹類群，親緣關(guān)系近，但同目不同科間支持率也基本為100%，該結(jié)果也說(shuō)明石竹目植物間系統(tǒng)進(jìn)化可信度較高。本研究只是基于紫茉莉科植物的系統(tǒng)發(fā)育分析，葉子花屬、紫茉莉?qū)俚榷寄芫墼谕环种?，這與上述研究結(jié)果基本一致。

致謝：本研究光葉子花葉綠體基因組序列自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載，特此感謝Ni等作者。