劉燕

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009)

油茶(Camelliaspp.)是對山茶屬(CamelliaL.)植物中種子含油率較高且有一定栽培經(jīng)營面積的樹種的統(tǒng)稱[1]。油茶作為我國重要的木本油料樹種，距今已有2 300多年的栽培和利用歷史[2]。油茶樹全身都是寶，其在食品、藥品、化工等方面用途廣泛，同時，其生態(tài)適應(yīng)性強，既可作綠化荒山荒地之用又能作保持水土、涵養(yǎng)水源之用，具有很高的經(jīng)濟和生態(tài)效益[3]。威寧短柱油茶(CamelliaweiningensisY.K.Li)屬山茶科(Theaceae)山茶屬植物，是一種野生油茶，1977年發(fā)現(xiàn)于貴州省威寧縣[4-5]，1980年該種確立[5]，1998年歸并入怒江紅山茶(C.saluenensisStapf ex Bean)[6]，威寧短柱油茶成為怒江紅山茶威寧種源的統(tǒng)稱。威寧短柱油茶除了具有普通油茶耐旱、耐土壤瘠薄的特性外，還具有耐寒、果實早熟、殼薄、出油率高、油質(zhì)好等特性[5]，具有很高的開發(fā)利用價值。目前，威寧短柱油茶種苗繁育方式主要以種子繁殖為主，但種子育苗周期長，無法在短時間內(nèi)滿足大量用苗需求。扦插繁殖已成為油茶快速育苗技術(shù)之一[7]。威寧短柱油茶生長緩慢，扦插生根困難，要想獲得高效扦插繁育技術(shù)，須先了解其插穗生根過程及其生根機理，才能解決其生根率低、發(fā)根慢等生產(chǎn)問題，從而為威寧短柱油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定堅實的基礎(chǔ)。

有關(guān)油茶扦插繁殖技術(shù)的研究已有較多報道，但僅有少部分研究者關(guān)注了其生根機理[8-10]。如：王瑞等[8]研究表明可溶性糖、可溶性蛋白含量積累和POD活性對普通油茶(C.oleiferaAbel.)的扦插有一定影響；謝一青等[9]發(fā)現(xiàn)PPO、POD、IAAO 3種酶活性會影響小果油茶(C.meiocarpaHu,)和普通油茶扦插生根；葉小萍等[10]則認為插穗C/N比是軟枝油茶2號(C.oleifera‘Cenxiruanzhi II’)生根的關(guān)鍵，比值越高其生根率越高。然而，威寧短柱油茶扦插生根機理卻鮮有報道。本研究以15 a生威寧短柱油茶半木質(zhì)化枝條為試驗材料，研究其插穗在扦插生根過程中的外部形態(tài)、內(nèi)部解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及插穗內(nèi)源激素、酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)的動態(tài)變化，以期從形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和生化特性方面了解其插穗生根過程及其生理生化特性，為威寧短柱油茶扦插育苗技術(shù)體系的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在貴州省威寧縣爐山鎮(zhèn)新豐村新秀合作社簡易大棚內(nèi)進行，扦插時間為2020年8月。扦插前將大棚內(nèi)土壤耙平，開廂面，在每個廂面上鋪墊10 cm厚的黃沙壤，再鋪設(shè)3～5 cm厚的珍珠巖構(gòu)成苗床。選取15 a生威寧短柱油茶半木質(zhì)化枝條，制備成插穗，插穗長約5～6 cm，上剪口平齊下剪口斜剪呈馬蹄狀。將插穗分成2組，每組500株，一組使用生根劑處理(速蘸ABT生根液1 000 mg/L 5s)(處理組)，一組使用清水處理(對照組)，將處理好的插穗插入苗床中(扦插深度以腋芽和葉柄露出土面為準，葉片統(tǒng)一為一個方向)，澆足水后按張云龍等[11]覆膜方式在苗床上覆蓋透明膜保濕。簡易大棚外部覆蓋遮陽網(wǎng)(遮陽率75%～80%)，棚內(nèi)保持濕度85%、溫度28 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 生根過程形態(tài)學(xué)觀察

自扦插日始的90 d內(nèi)每隔5 d檢查1次插穗。每次觀察插穗基部外部形態(tài)并拍照，記錄插穗出現(xiàn)愈傷組織時間、愈傷組織大量形成時間、不定根發(fā)生時間和不定根大量形成時間。

1.2.2 生根過程解剖學(xué)觀察

在插穗出現(xiàn)愈傷組織時期、愈傷組織大量形成時期、不定根出現(xiàn)時期和不定根大量形成時期4個階段取樣，每次取樣5根。采用石蠟切片法制片、番紅固綠染色，使用Nikon光學(xué)顯微鏡觀察插穗莖的解剖結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.2.3 生根過程生理生化特性測定

自扦插日始60 d內(nèi)每隔15 d取1次樣，每次取樣5根，測定插穗生根過程中生理生化特性?？扇苄蕴遣捎幂焱壬?、可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法、過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法、多酚氧化酶(PPO)采用鄰苯二酚比色法測定[12]。吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)和玉米素核苷(ZR)采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體一步夾心法(ELISA)檢測[13]。試驗重復(fù)3次，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Excel 2007整理數(shù)據(jù)、SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Tukey法進行多重比較，顯著水平設(shè)置為α= 0.05；制圖用OriginPro 8軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 威寧短柱油茶插穗生根過程中形態(tài)學(xué)變化

扦插15 d后，插穗基部切口處膨脹，插穗的皮層與木質(zhì)部逐漸分開，并伴有少量白色的愈傷組織在插穗的皮層與木質(zhì)部間(圖1A)。扦插30 d后插穗基部出現(xiàn)明顯的白色愈傷組織，瘤狀突起明顯，有些愈傷組織出現(xiàn)白色根突，插穗上部保留的葉芽膨大明顯(圖1B)。扦插50～60 d后插穗膨大的葉芽逐步伸長，長出嫩葉，插穗基部愈傷組織或皮層出現(xiàn)不定根，其數(shù)量在8根以下，根長1～2 cm(圖1C)。扦插90 d時，插穗葉芽伸長成嫩枝，插穗基部不定根快速生長，數(shù)量明顯增多，有側(cè)根出現(xiàn)，長度達6 cm左右(圖1D)。可見，威寧短柱油茶插穗扦插至生根耗時較長，從扦插到形成大量不定根時間需要約90 d。威寧短柱油茶插穗生根為混合型生根類型，即不定根既可以發(fā)生在皮層，也可以發(fā)生在愈傷組織，故可清楚地看到不定根從皮層或愈傷組織長出(圖1E、F)，但愈傷組織生根數(shù)量明顯比皮層生根數(shù)量多。

2.2 威寧短柱油茶插穗生根過程解剖學(xué)觀察

威寧短柱油茶插穗莖橫切面和其他植物莖橫切面相似，均由表皮、皮層、維管束、髓共4部分組成。插穗半木質(zhì)化枝條解剖結(jié)構(gòu)顯示，威寧短柱油茶莖中未有根原始體的存在，且皮層中有一圈明顯連續(xù)的厚壁細胞(圖2A)，表明威寧短柱油茶屬于生根困難型植物。插穗扦插15～20 d時，在插穗基部皮層區(qū)域中可觀察到排列緊湊，分裂性強的細胞群體(圖2B)，這些細胞跟周圍其他細胞存在較大的差異，在之前插穗切片中未觀察到，可以推斷這些細胞為誘發(fā)以后形成的根原基細胞?？梢?，威寧短柱油茶根原基的產(chǎn)生與皮層細胞有關(guān)。在后續(xù)發(fā)育過程中，根原基細胞不斷出現(xiàn)分裂活動，整個細胞群體開始不斷縱橫拉伸，向外將表皮等其他類型的細胞擠到外端，向內(nèi)與維管束相通，形成不定根。

2.3 威寧短柱油茶插穗生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)變化

處理組和對照組插穗可溶性蛋白和可溶性糖含量隨扦插時間的推進均呈現(xiàn)“先降后升”的變化趨勢，但可溶性蛋白和可溶性糖變化趨勢稍有不同(圖3)?？扇苄缘鞍自?～15 d內(nèi)迅速下降，15 d后明顯上升，到60 d時含量最高，對照組含量為14.37 μg/g，略比0 d時13.80 μg/g高0.57 μg/g，但處理組可溶性蛋白含量(19.77 μg/g)達到了0 d時含量1.43倍；可溶性糖含量在0～30 d內(nèi)下降明顯，30 d后又緩慢增加，到60 d時處理組(58.87 μg/g)和對照組(53.53 μg/g)可溶性糖含量都低于0 d含量(59.81 μg/g)。方差分析結(jié)果顯示，在30 d后，處理組的可溶性蛋白和可溶性糖含量始終高于對照組，差異顯著(P<0.05)。

2.4 威寧短柱油茶插穗生根過程中氧化酶活性變化

多酚氧化酶、過氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶活性在生根過程中其變化趨勢存在差異(圖4)。PPO、POD 活性變化趨勢一致，兩種酶對照組和處理組的值均隨扦插時間延長而“逐步升高”，而IAAO活性卻呈現(xiàn)“先降低-后升高”趨勢。扦插15 d后，插穗的PPO和POD 的活性急劇增加，到60 d時升至最高水平。IAAO活性在0～15 d先降低，而在15 d后開始明顯升高，直至60 d 最高。在60 d內(nèi)，處理組的 PPO、POD 含量始終高于對照組，差異顯著(P<0.05)；IAAO含量在扦插后30 d后處理組的值始終高于對照組的值，差異顯著(P<0.05)。

2.5 威寧短柱油茶插穗生根過程中內(nèi)源激素含量變化

隨著扦插時間的推移，威寧短柱油茶插穗內(nèi)源激素含量均發(fā)生了變化，且變化趨勢不一致(圖5)。IAA含量隨時間推移對照組和處理組均出現(xiàn)增加，在60 d內(nèi)，處理組的 IAA含量始終高于對照組，差異顯著(P<0.05)。ABA含量隨扦插時間推移下降明顯，0～30 d時，ABA處理組比對照組含量略高，但30～60 d時，處理組含量明顯比照組低，差異顯著(P<0.05)。GA和ZR變化趨勢有相似性，即GA和ZR處理組均是在扦插前期時含量迅速降低(GA在15 d時降至最低，ZR在30 d時降至最低)，扦插后期含量迅速升高，而對照組均表現(xiàn)出“降低-升高-降低-升高”的雙峰走勢。

由威寧短柱油茶插穗生根過程中內(nèi)源激素比例變化(表1)可見：IAA/ABA比值隨扦插時間推移而逐步升高，每個時間節(jié)點處理組始終高于對照組，差異顯著(P<0.05)；IAA/ZR比值在0～30 d內(nèi)不管是處理組還是對照組比值都迅速升高，但在30 d后，處理組比值逐漸降低，而對照組的比值略有升高，從整個扦插時間(60 d)來看，除30 d外，處理組比值始終低于對照組比值，差異顯著(P<0.05)；IAA/GA比值從15 d開始不管是處理組還是對照組的值都迅速升高，但對照組的值逐步升高后在60 d才開始下降，而處理組卻呈現(xiàn)“升高-下降-升高-下降”趨勢，從整個扦插時間(60 d)來看，處理組比值始終高于對照組比值，差異顯著(P<0.05)。

表1 威寧短柱油茶插穗生根過程中內(nèi)源激素比例變化

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

威寧短柱油茶插穗扦插生根過程和大多數(shù)植物相似，根據(jù)其愈傷組織出現(xiàn)時間到大量不定根形成時間來劃分，可將其分為愈傷組織的形成期(扦插0～15 d)、不定根的誘導(dǎo)期(扦插15～30 d)、不定根的發(fā)生期(扦插50～60 d)和不定根的伸長期(扦插60～90 d)。這和葉小萍等[14]觀察軟枝油茶插穗生根時期一致，但威寧短柱油茶發(fā)根時間稍微比軟枝油茶早10 d。王改萍等[15]研究楸樹(CatalpabungeiC.A.Mey.)扦插生根發(fā)育過程時發(fā)現(xiàn)，楸樹插穗生根時期也分為4個時期—愈傷組織的形成時期(扦插3～7 d)、不定根的誘導(dǎo)時期(扦插7～18 d)、不定根的發(fā)生時期(扦插18～20 d)和不定根的伸長時期(扦插20 d)，其每個扦插發(fā)育時期均比威寧短柱油茶扦插發(fā)育時期短，這表明樹種不同，插穗根系發(fā)育時間也不一致。植物插穗生根難易程度與其解剖學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，插穗不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵在于根原基是否能在莖內(nèi)部產(chǎn)生和皮層中是否有連續(xù)的厚壁細胞[16-17]。如圓柏(Sabinachinensis(L.)Ant.)[18]、土豆(SolanumtuberosumL.)[19]、野葛(Puerarialobate(Willd.)Ohwi)[20]，這類植物枝條內(nèi)存在潛伏的不定根原基并且無連續(xù)的厚壁細胞，只要給予適合的外部條件，就很容易生根。威寧短柱油茶莖內(nèi)部沒有潛在的不定根原基細胞，且皮層細胞中有一圈明顯連續(xù)的厚壁細胞，屬于生根困難型植物，因此扦插時需要使用外源激素(生根劑)幫助其誘導(dǎo)根原基形成和破除連續(xù)的厚壁細胞，才能使其扦插成功。這和葉小萍等[14]研究軟枝油茶扦插生根結(jié)果一致。

營養(yǎng)物質(zhì)是插穗產(chǎn)生不定根的必要條件，它為插穗在生根過程中提供所需的基本物質(zhì)和能量[21]。本研究中可溶性糖和可溶性蛋白在處理組和對照組中其含量均表現(xiàn)出隨扦插時間的推移“先降后升”的變化趨勢。扦插前期為了促使莖內(nèi)產(chǎn)生根原基細胞，插穗可溶性蛋白和可溶性糖開始生物降解，為插穗根原基的產(chǎn)生提供所需要的物質(zhì)能量；當(dāng)不定根形成后，不定根從扦插土壤中吸收到營養(yǎng)物質(zhì)和水分，促使插穗不定芽的萌發(fā)和生長，營養(yǎng)物質(zhì)積累量增加，所以扦插后期可溶性糖和可溶性蛋白含量增加明顯。方差分析結(jié)果顯示，可溶性蛋白在扦插15 d后、可溶性糖在扦插30 d后，處理組的可溶性蛋白和可溶性糖含量始終高于對照組，差異顯著(P<0.05)，表明外源激素處理顯著提高了插穗不定根形成時期可溶性蛋白和可溶性糖含量。這與葉小萍等[10]用外源激素處理油茶插穗提高了插穗體內(nèi)可溶性糖含量的結(jié)果相似。可溶性糖與可溶性蛋白含量的增加，為插穗形成大量不定根提供充足的營養(yǎng)，促使插穗產(chǎn)生根原基細胞，提高生根率和縮短生根時間。

插穗基部酶活性與插穗生根有著密切的關(guān)聯(lián)，其中影響最大的是多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)[22]。本研究中，在愈傷組織誘導(dǎo)階段(0～15 d)，PPO和POD活性均上升，IAAO降低。表明高濃度的PPO和POD，低濃度IAAO有利于愈傷組織誘導(dǎo)；在15～60 d，PPO、POD、IAAO等3種酶活性均出現(xiàn)迅速增加，到60 d時達最大值。這表明威寧短柱油茶不定根誘導(dǎo)期、不定根形成期和不定根伸長期都需要高濃度的PPO、POD、IAAO。POD能夠清除插穗內(nèi)部不利于生根的自由基等容易損傷插穗的物質(zhì)；PPO可以催化插穗內(nèi)酚類物質(zhì)氧化與IAA合成“IAA-酚酸復(fù)合物”(一種生根輔助因子)，可以促進不定根的形成和生長；IAAO能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)IAA的含量來影響插穗不定根的誘導(dǎo)過程[23]。可見，在威寧短柱油茶插穗生根過程中，自由基的清除、“IAA-酚酸復(fù)合物”的形成和IAA的調(diào)節(jié)都必不可少。本研究的PPO、POD、IAAO酶活性變化趨勢和謝一青等[9]研究小果油茶扦插酶活性變化趨勢稍有不同，可能是油茶種類、扦插時間、扦插激素、扦插基質(zhì)等原因造成的差異。

插穗不定根形成與植物激素密切相關(guān)已被眾多研究所證實[23-26]。本研究中，隨扦插時間的推移，IAA含量增加明顯，ABA含量則是逐漸下降，GA和ZR在扦插前期時含量迅速降低，扦插后期含量迅速升高(GA在15 d后升高，ZR在30 d后升高)，表明在扦插前期(0～15 d)高濃度IAA和低濃度ABA、GA、ZR有利于愈傷組織形成，扦插后期(15～60 d)高濃度IAA、GA、ZR和低濃度ABA有利于不定根誘導(dǎo)和伸長。與對照相比，處理組的IAA含量始終高于對照組；ABA含量在扦插30～60 d時，處理組含量始終顯著低于對照組(P<0.05)。表明外源激素提高了插穗中IAA、ZR和GA含量，降低了ABA含量，促進了不定根的形成。本研究結(jié)果與普通油茶和油茶栽培品種‘云油茶’系列扦插研究結(jié)果一致[27-28]。植物扦插生根在探討激素含量變化時，還需研究其比值才能更能全面評價植物激素對不定根發(fā)育的效應(yīng)[23]。王艷晶[29]研究發(fā)現(xiàn)，高IAA/ABA比值可促進國槐(SophorajaponicaLinn)插穗根原基的誘導(dǎo)和分化。王東光[30]研究結(jié)果表明，高水平的IAA/ZR有利于不定根的發(fā)生，IAA/ZR上升則有利于不定根的形成。表明高濃度IAA/ABA和IAA/ZR對植物扦插生根有顯著影響。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，在生根過程中威寧短柱油茶插穗的IAA/ABA和IAA/ZR比值較高。本研究中，IAA/GA隨扦插時間推進處理組和對照組比值變化趨勢不一致，但從整個扦插時間(60 d)來看，處理組比值始終顯著高于對照組比值(P<0.05)，IAA/GA與插穗生根的關(guān)系是否密切，還需要更多研究來證實。

3.2 結(jié)論

威寧短柱油茶插穗從扦插到形成大量不定根耗時較長，約為90 d。插穗莖內(nèi)部沒有潛伏的不定根原基細胞，且皮層細胞中有一圈連續(xù)的厚壁細胞，屬于生根困難型植物，需要外源激素處理才能誘導(dǎo)根原基細胞的產(chǎn)生和不定根的發(fā)生。插穗在扦插30 d后需要大量的可溶性糖和可溶性蛋白、高濃度的PPO、POD、IAAO酶活性、高含量的IAA、ZR、GA和低含量ABA、高比值的IAA/ABA、IAA/ZR等生理條件來促進不定根的誘導(dǎo)和發(fā)育。外源激素處理顯著促進了插穗基部可溶性糖、可溶性蛋白的積累，提高插穗PPO、POD和IAAO等氧化酶活性，加速插穗營養(yǎng)物質(zhì)代謝和細胞分裂；同時還增加了插穗IAA、ZR、GA含量和IAA/ABA、IAA/ZR比值，降低ABA含量，有效調(diào)節(jié)插穗內(nèi)植物激素的平衡，為插穗的不定根誘導(dǎo)和形成提供有利條件。